miR－503在结直肠癌组织和细胞中的表达及对细胞增殖、凋亡的影响

何学彦　张　超(遵义医学院第三附属医院普外科，贵州　遵义　563002)



miR－503在结直肠癌组织和细胞中的表达及对细胞增殖、凋亡的影响

何学彦张超1(遵义医学院第三附属医院普外科，贵州遵义563002)

〔摘要〕目的探讨microRNA－503( miR－503)在结直肠癌组织和细胞中的表达情况及其对细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法采用实时定量PCR( qPCR)检测54例结直肠癌组织及4种结直肠癌细胞( SW480、Lovo、LS174T和HT－29)中的miR－503水平，分析结直肠癌组织miR－503表达与常见临床病理参数的关系，采用脂质体转染miR－503模拟物( mimics)至miR－503水平最低的细胞，采用MTT法、流式细胞仪及Transwell法检测过表达miR－503对细胞增殖、凋亡、细胞周期和侵袭的影响。结果54例结直肠癌组织的miR－503相对表达量为( 0．257±0．011)，低于癌旁组织( P＜0．05)，且miR－503水平与TNM分期、分化情况、肿瘤大小和术前癌胚抗原均有关( P＜0．05) ;与人正常结肠细胞系CCD－18Co相比，4种不同恶性程度结直肠癌细胞SW480、Lovo、LS174T和HT－29的miR－503相对表达量依次为( 0．342±0．072)、( 0．161±0．054)、( 0．260±0．041)和( 0．415± 0．086)，差异均有统计学意义( P＜0．05) ;与对照组相比，转染miR－503 mimics后的细胞增殖抑制率和凋亡率均升高，G0/G1期细胞比例升高，S期和G2/M期细胞比例均降低，穿膜细胞数减少( P＜0．05)。结论miR－503在结直肠癌组织和细胞中低表达，且与结直肠癌的临床病理参数有关，上调miR－503水平可抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭并诱导细胞周期阻滞和凋亡。

〔关键词〕iR－503;结直肠癌;细胞;增殖;凋亡

1第三军医大学西南医院普通外科

第一作者:何学彦( 1966－)，男，副主任医师，主要从事胃肠疾病研究。

结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，在我国发病率和死亡率均较高，确诊患者大多数已为晚期，治疗手段局限，预后较差〔1〕。microRNA( miR)是一种保守的内源性非编码基因，可调节多种生物学过程，目前发现多种miRs在肿瘤组织中异常表达，且与其恶性行为调节有关，探讨与恶性肿瘤发生发展有关的miRNA已成为肿瘤防治热点〔2，3〕。miR－503已证实在非小细胞肺癌中低表达，且与患者预后较差有关〔4〕，同时可抑制前列腺癌细胞的增殖与转移〔5〕，以上结果提示其可能在恶性肿瘤中发挥着抑癌基因的作用。目前尚无miR－503在结直肠癌中表达的报告，其在结直肠细胞中的功能尚不清楚，故本研究拟首先检测miR－503在结直肠癌组织及细胞中的表达情况，并通过脂质体转染法验证其对细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。

1材料与方法

1. 1组织样本收集本院2012年5月至2014年12月的结直肠癌术后标本54例及5 cm处癌旁无瘤黏膜组织，均经病理证实且术前未接受放化疗，其中男32例，女22例;年龄32～71岁，中位年龄56．5岁;肿瘤位置:结肠32例，直肠22例; TNM分期:Ⅰ、Ⅱ期31例，Ⅲ、Ⅳ期23例;分化情况:中、低分化27例，高分化27例; 20例有淋巴结转移。

1. 2试剂及仪器4种不同恶性程度的人结直肠癌细胞株( SW480、Lovo、LS174T和HT－29)及正常结肠细胞系CCD－18Co均购自上海中科院生化细胞所，RNA抽提试剂盒Trizol、脂质体试剂Lipofectamine 2000TM购自美国Invitrogen公司，SYBR Green 2×Mix均购自宝生物(大连)工程有限公司，miR－503模拟物( mimics)由锐博生物(中国)公司设计合成，噻唑蓝( MTT)购自美国Amresco公司。流式细胞仪FACS－CALIBUR型为美国BD公司产品，Prism 7000 PCR仪为美国ABI公司产品。

1. 3实时定量PCR( qPCR)采用TRIzol法提取组织和细胞中的总RNA，以符合试验要求的RNA为模板，利用AMV反转录试剂盒进行逆转录反应，反应条件为: 1630 min，42℃30 min，85℃5 min;在ABI Prism 7000实时荧光定量PCR仪上进行qPCR扩增，反应条件为: 95℃预变性10 min，( 95℃15 s，60℃1 min)×40个循环。qPCR引物由Premier Primer 5．0 software设计: miR－503上游引物: 5'－CGCGGGATCGGGTCAGA－3'，下游引物: 5'－GGGAACATGTTGATCTCAG－3';内参U6上游引物: 5'－CTCGCTTCGGCAGCACA－3'，下游引物: 5'－AACGCTTCACGAATTTGCGT－3'。2－△△Ct法测定组织和细胞中的miR－503表达情况。每组实验重复3次。

1. 4细胞转染待结直肠癌细胞汇合度约70%时，将细胞置于无RNA酶的EP管(含200 μl Opti－MEM培养基)，加入5 μl 50 nmol/L的miR－503 mimics进行细胞转染，分别于转染96 h采用qPCR法检测miR－503水平。

1. 5 MTT法分别于转染24、48、72、96 h后采用MTT法检测细胞增殖情况，避光4 h，用加样枪每孔加入DMSO 200 μl，采用酶标仪检测490 nm波长下各孔吸光值( A)，其中未转染的结直肠癌细胞为对照组，采用脂质体法转染miR－503 mimics的为转染组，根据公式计算增殖抑制率，增殖抑制率( %) = 1－A转染组/A对照组×100%。每组实验重复3次。

1. 6流式细胞仪将细胞转染48、96 h后按2×105个/ml的密度接种，24 h后收集用冷乙醇固定，加入RNase后按照BD试剂盒说明书步骤完成Annexin V－FITC/PI双染或PI单染后，15 min后上机测定凋亡率和细胞周期。每组实验重复3次。

1. 7 Transwell实验将准备好的12孔板嵌套Transwell小室，选取指数生长期细胞，用DMEM(含1%小牛血清)稀释制备3．5×104个/ml的细胞悬液;细胞悬液按每孔100 μl加入Transwell小室，每组3孔，Transwell下室加入DMEM( 10%小牛血清) ;36 h后弃去孔内培养液用棉签拭去上室未穿膜的细胞，结晶紫染色后，上室倒置于显微镜下计数穿膜细胞数。每组实验重复3次。

1. 8统计学分析采用SPSS18．0软件处理。计量资料以x±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2. 1 miR－503水平与结直肠癌临床病理参数的关系结直肠癌组织的miR－503相对表达量为( 0．257±0．011)，低于癌旁组织( P＜0．05)。54例结直肠癌组织中miR－503水平与TNM分期、分化情况、肿瘤大小和术前癌胚抗原( CEA)均有关，其中TNMⅢ、Ⅳ期，中、低分化，肿瘤大小＞5 cm和术前CEA＞5．0 ng/ml者的miR－503水平依次为0．121±0．009、0．112± 0．012、0．149±0．017和0．155±0．023，均低于相应项目( 0．358± 0．032、0．402±0．049、0．392±0．031、0．327±0．030) ( P＜0．05)，miR－503水平与性别(男: 0．249±0．011，女: 0．268±0．014)年龄(≤50岁: 0．261±0．012，＞50岁: 0．253±0．009)、淋巴结转移(有: 0．251±0．025，无: 0．260±0．016)、肿瘤位置(结肠: 0．262± 0．017、直肠: 0．249±0．026)等其他参数无关( P＞0．05)。

2. 2 miR－503在不同恶性程度结直肠癌细胞中的表达情况

与人正常结肠细胞系CCD－18Co相比，4种不同恶性程度结直肠癌细胞SW480、Lovo、LS174T和HT－29的miR－503相对表达量依次为( 0．342±0．072)、( 0．161±0．054)、( 0．260±0．041)和( 0．415±0．086)，差异均有统计学意义( P＜0．05)，同时后续试验选择miR－503表达量最低的Lovo细胞。

2. 3过表达miR－503对Lovo细胞增殖的影响转染miR－503 mimics 96 h后采用qRT－PCR检测Lovo细胞中miR－503水平，图1A显示较对照组，转染组的miR－503表达量升高，且升高至对照组的( 6．124±0．024)倍，差异有统计学意义( P＜0．05) ;图1B显示转染组转染24、48、72和96 h后的增殖能力受抑制，增殖抑制率随转染时间延长而升高( P＜0．05)。

2. 4过表达miR－503对Lovo细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示对照组和转染组转染48 h的Lovo细胞总凋亡率分别为( 4．92±0．83) %和( 21．75±2．61) %，而转染96 h的总凋亡率分别为( 6．24±1．02) %和( 37．02±4．42) %，与对照组相比，转染组转染48、96 h的总凋亡率升高，差异有统计学意义( P＜0．05)。

2. 5过表达miR－503对Lovo细胞周期的影响流式细胞仪检测结果显示与对照组相比，转染组转染96 h后的G0/G1期细胞比例升高，S期和G2/M期细胞比例均降低，差异有统计学意义( P＜0．05)。见表1。

2. 6过表达miR－503对Lovo细胞侵袭的影响Transwell法检测结果显示对照组和转染组转染24 h的Lovo细胞的穿膜细胞数分别为( 87．1±7．2)和( 55．2±4．8)个，而转染48 h的穿膜细胞数分别为( 145．7±11．6)和( 87．0±8．4)个，与对照组相比，转染组转染24、48 h的穿膜细胞数减少，差异有统计学意义( P＜0．05)。见图1。

表1过表达miR-503对Lovo细胞周期的影响( %)

图1过表达miR-503后Lovo细胞的Transwell实验图

3讨论

转录后调控在多种细胞过程发挥重要作用，如发展，神经发生和癌变〔6〕。miRNAs是一种重要转录后调节因子，可抑制mRNA转位并通过与靶基因mRNA 3'－UTR配对来诱导其断裂〔3，7〕。异常表达的miRNAs及其靶基因调控紊乱是目前恶性肿瘤防治的研究热点，研究发现miRNAs的异常调控可导致癌症的发生、进展、转移及耐药〔6〕。

miR－503是一个基因内部miRNA，位于Xq26．3，属于扩展的miR－16家族〔8〕。miRNA芯片分析表明，与相应正常组织相比，miR－503表达水平在不同肿瘤的趋势存在差异，如在口腔癌，非小细胞肺癌、肝癌和子宫内膜癌中表达降低〔4，8～10〕，而在肾上腺皮质癌，甲状旁腺癌和视网膜母细胞瘤中表达升高〔11～13〕。生物学功能研究发现miR－503具有肿瘤抑制作用，如可抑制人头颈部鳞癌细胞增殖及减少肝细胞癌细胞转移〔8，12〕。本研究发现结直肠癌组织和细胞中的miR－503均为低表达，与在非小细胞肺癌及肝癌等肿瘤中的趋势一致〔8，11〕，表明miR－503在结直肠癌发生发展中起抑癌基因的作用。进一步分析发现，miR－503表达与TNM分期、分化情况、肿瘤大小和术前CEA均有关，且以上指标恶性程度越高、其miR－503水平越低，同时也提示miR－503水平可能有助于结直肠癌的病情评估。

由于Lovo细胞的miR－503水平最低，故本研究选取了Lovo细胞并通过脂质体转染miR－503 mimics来上调其水平，以验证miR－503在结直肠癌中的调控效果。结果表明转染成功且持续时间长，便于连续观测细胞学行为变化。本研究结果表明miR－503可抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移并诱导凋亡，且随着转染时间延长，抑制效应也增强。Guo等〔5〕的研究发现miR－503可抑制前列腺癌细胞的增殖和转移，Peng等〔6〕发现miR－503对乳腺癌的增殖亦有抑制效果，结合以上研究和本结果得出miR－503对于恶性肿瘤具有较广的抑制效果，针对miR－503设计的治疗策略，不仅会使结直肠癌患者受益，而且对于其他恶性肿瘤的防治也亦有较大价值。本研究发现miR－503可诱导结直肠癌细胞周期阻滞，使绝大多数细胞停留在G0/G1期，这也可能是其抑制细胞增殖和诱导凋亡的一个原因，可能与其靶基因在细胞周期中的调控作用有关。

4参考文献

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〔2015－02－13修回〕

(编辑徐杰)

·呼吸、消化系统疾病·

〔中图分类号〕R734

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202( 2016) 02-0369-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 053