胞质Rap1与胞核NF－κBp65在胃癌组织中的表达及相关性

赵　丹　王　进　宁寒冰　杨丽敏　(郑州大学第一附属医院消化内科，河南　郑州　450052)



胞质Rap1与胞核NF－κBp65在胃癌组织中的表达及相关性

赵丹王进宁寒冰杨丽敏(郑州大学第一附属医院消化内科，河南郑州450052)

〔摘要〕目的探讨胞浆Rap1和胞核NF－κB p65在胃癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法采用免疫组织化学的方法检测92例胃癌及癌旁正常组织Rap1和NF－κB p65的表达。结果胃癌组织胞质Rap1平均染色评分为6．53±0．38，明显高于癌旁正常组织( 1．70±0．10，P＜0．001)。Rap1胞质表达水平与胃癌的分化程度、TNM分期及淋巴结转移相关( P＜0．05)，与年龄、性别无关;胃癌组织胞核NF－κB p65表达明显高于癌旁正常组织( 7．12±0．42 vs 1．74±0．05，P＜0．001)。胞质Rap1和胞核NF－κB p65在胃癌组织中的表达呈显著正相关( Kendall'stau－b= 0．447，P＜0．001)。结论胃癌组织Rap1胞质表达可能与NF－κB介导的信号转导通路相关，共同参与胃癌的发生发展。

〔关键词〕Rap1; NF－κB p65;胃癌

端粒是位于染色体末端的DNA－蛋白结构，由TTAGGG重复序列和大量的端粒结合蛋白组成。六个端粒结合蛋白TRF1、TRF2、Rap1、POT1、TIN2和TPP1组成Shelterin复合体〔1，2〕。大量的研究证明端粒结合蛋白在肿瘤的发生发展中起重要作用。Rap1是TRF2相互作用因子，在端粒与TRF2组成Shelterin复合体的亚单位，人类细胞胞质中存在一定数量的Rap1蛋白，这部分Rap1不与TRF2结合且不受TRF2表达水平的影响。Rap1主要在端粒发挥作用，Rap1蛋白也具有端粒外功能〔3～5〕，近期研究表明胞质Rap1蛋白与IκB激酶( IKKs)相互作用，磷酸化核转录因子( NF)－κB的p65亚基，激活NF－κB。在乳腺癌组织中胞质Rap1表达增加〔6〕，但Rap1在胃癌发生发展中的作用仍不清楚。本研究通过检测Rap1、NF－κB p65在胃癌组织中的表达及相关性，探讨其在胃癌发生发展中的可能作用及临床意义。

1材料和方法

1. 1材料收集郑州大学第一附属医院2013年4月至2015 年7月92例胃癌及癌旁正常组织石蜡标本。所取标本均通过了郑州大学第一附属医院伦理委员会的批准，全部患者均知情同意，且术前均未接受化、放疗及免疫治疗。男56例，女36 例;年龄40～83岁，≤60岁41例，＞60岁51例，中位年龄50．3岁。病理分型均为腺癌:高分化30例，中分化34例，低分化28 例; TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期53例;不伴淋巴结转移49例，伴淋巴结转移43例。鼠抗人Rap－1单克隆抗体和鼠抗人NF－κB p65单克隆抗体均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司; SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1. 2方法所有标本均经40 g/L甲醛固定，常规石蜡包埋后切成厚约4 μm切片，脱蜡水化，高温高压修复，应用SP免疫组织化学染色法，具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。以已知的阳性胃癌切片作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液( PBS)代替一抗作为阴性对照。

1. 3结果判定阳性细胞染色呈棕黄色或棕褐色。Rap1为胞质与胞核着色，以胞质着色判断为阳性。NF－κB p65为胞质与胞核着色，以胞核着色判断为阳性。每张切片随机选择5个高倍镜视野，每个视野计数200个细胞，按阳性细胞占视野细胞总数的百分比评分( R) : 0分，＜1%; 1分，2%～25%; 2分，26%～50%; 3分，51%～75%; 4分，＞75%;按照染色强度评分( I) :不着色，0分;淡棕色，1分;棕色，2分;深棕色，3分;总分为R×I:阴性，0～1分;弱阳性，2～4分;中度阳性，5～8分;强阳性，9～12分。每张切片由两位高年资病理科医师双盲随机观察。

1. 4统计学方法应用SPSS21．0软件行t检验、Mann－Whitney U检验和Kendall tau rank correlation co－efficient相关性分析。

2结果

2. 1 Rap1在胃癌和癌旁正常组织中的表达Rap1在癌旁正常组织主要为胞核染色，胞质染色较弱(图1A)，胞质平均染色评分为1．70±0．10;胃癌组织胞质Rap1表达增加(图1B～图1D)，平均染色评分为6．53±0．38，明显高于癌旁正常组织( P＜0．001)。Rap1胞质表达水平与胃癌的分化程度、TNM分期及淋巴结转移明显相关( P＜0．05)，与年龄、性别不相关。见表1。

2. 2 NF－κB p65在胃癌和癌旁正常组织中的表达胃癌组织胞核NF－κB p65平均染色评分为7．12±0．42，明显高于癌旁正常组织( 1．74±0．05，P＜0．001)。

2. 3胞质Rap1表达和胞核NF－κB p65表达的相关性胞质Rap1和胞核NF－κB p65在胃癌组织中的表达呈显著正相关( Kendall'stau－b=0．447，P＜0．001)。

A: Rap1在癌旁正常组织中的表达; B: Rap1在高分化胃癌组织中的表达; C: Rap1在中分化胃癌组织中的表达; D: Rap1在低分化胃癌组织中的表达; E: NF－κB p65在胃癌中的表达图1 Rap1在胃癌及癌旁正常组织及NF-κB p65在胃癌组织中的表达( SP×200，嵌入小图×400)

表1胃癌组织中胞质Rap1表达与临床病理参数的关系( n)

3讨论

胃癌早期多无明显症状或症状不典型，绝大多数患者在确诊时已处于中晚期，生存率低，预后差〔7〕。因此，对于胃癌的相关基础及临床研究，显得愈发重要。

Rap1作为端粒Shelterin复合体的核心蛋白之一，最初是在酿酒酵母菌中被发现的〔5〕。目前研究表明哺乳动物Rap1至少具有2种端粒外功能:转录调控，在胞质激活NF－κB信号通路〔3～5〕。最新研究提示Rap1可能通过端粒外功能参与肿瘤的发生发展: Rap1在乳腺癌细胞质表达增加，通过激活NF－κB信号系统促进转移性和侵袭性，增加对凋亡诱导剂的耐受性〔6〕; Rap1通过调节DNA损伤反应与TRF2共同参与胃癌多药耐药的发生〔8〕。本研究结果提示胞质Rap1表达与胃癌的发生发展相关。

Teo等〔6〕研究发现，胞质Rap1与IKKs形成复合体，通过IKKs介导NF－κB p65亚单位的磷酸化，而非通过磷酸化抑制蛋白IκBs，从而激活NF－κB信号系统。NF－κB信号通路已被证实在多种恶性肿瘤的发生发展中起重要促进作用〔9〕。本研究结果显示，Rap1胞质表达可能与NF－κB介导的信号转导通路相关，共同参与胃癌的发生发展。

综上所述，胃癌组织Rap1胞质表达可能与NF－κB介导的信号转导通路相关，共同参与胃癌的发生发展，深入研究Rap1的非端粒功能将为胃癌的诊断和治疗提供新的思路。

4参考文献

1 de Lange T．Shelterin: the protein complex that shapes and safe guards human telomeres〔J〕．Genes Dev，2005; 19( 18) : 2100－10．

2 Xin H，Liu D，Songyang Z．The telosome/shelterin complex and its functions〔J〕．Genome Biol，2008; 9( 9) : 232．

3 Martinez P，Thanasoula M，Carlos AR，et al．Mammalian Rap1 controls telomere function and gene expression through binding to telomeric and extratelomeric sites〔J〕．Nat Cell Biol，2010; 12( 8) : 768－80．

4 Sfeir A，Kabir S，van Overbeek M，et al．Loss of Rap1 induces telomere recombination in the absence of NHEJ or a DNA damage signal〔J〕．Science，2010; 327( 5973) : 1657－61．

5 Kabir S，Sfeir A，de Lange T．Taking apart Rap1: an adaptor protein with telomeric and non－telomeric functions〔J〕．Cell Cycle，2010; 9( 20) : 4061－7．

6 Teo H，Ghosh S，Luesch H，et al．Telomere－independent Rap1 is an IKK adaptor and regulates NF－kappaB－dependent gene expression〔J〕．Nat Cell Biol，2010; 12( 8) : 758－67．

7 Crew KD，Neugut AI．Epidemiology of gastric cancer〔J〕．World J Gastroenterol，2006; 12( 3) : 354－62．

8 Li X，Liu W，Wang H，et al．Rap1 is indispensable for TRF2 function in etoposide－induced DNA damage response in gastric cancer cell line〔J〕．Oncogenesis，2015; 4: e144．

9 Prasad S，Ravindran J，Aggarwal BB．NF－κB and cancer: how intimate is this relationship〔J〕．Mol Cell Biochem，2010; 336( 1－2) : 25－37．

〔2015－02－13修回〕

(编辑袁左鸣)

通讯作者:王进( 1958－)，女，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事消化系肿瘤方面的研究。

基金项目:河南省医学科技攻关项目( No．201303019)

〔中图分类号〕R73

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202( 2016) 02-0350-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 044

第一作者:赵丹( 1989－)，女，在读硕士，主要从事消化系肿瘤方面的研究。