经皮冠状动脉介入术后慢复流老年患者白细胞介素－33/ST2信号通路表达及临床意义

蓝景生　张　震罗　薇覃梓庆　赵艳英　(广西民族医院心血管内科，广西　南宁　53000)



经皮冠状动脉介入术后慢复流老年患者白细胞介素－33/ST2信号通路表达及临床意义

蓝景生张震1罗薇1覃梓庆赵艳英(广西民族医院心血管内科，广西南宁530001)

〔摘要〕目的探讨经皮冠状动脉介入( PCI)后慢复流老年患者L－33/ST2信号通路的表达及意义。方法行PCI患者210例，入院后行心电图检查，常规测量血压，检测血糖、血脂、白细胞介素( IL)－33和ST2 mRNA和蛋白测定，所有患者接受PCI治疗后根据术后心肌灌注分级分为慢复流组72例和正常血流组138例，分析IL－33和ST2 mRNA和蛋白表达与老年患者PCI术后慢复流的相关性。结果①慢复流组甘油三酯( TG)、总胆固醇( TC)和低密度脂蛋白( LDL)水平均较正常复流组显著升高( P＜0．01或P＜0．05) ;②慢复流组IL－33、ST2 mRNA和蛋白表达水平均较正常复流组显著升高( P＜0．01) ;③多因素Logistic回归分析显示TG、TC、LDL、IL－33 mRNA、IL－33蛋白、ST2 mRNA和ST2蛋白是PCI术后发生慢复流的危险因素。结论IL－33和ST2表达水平升高可能导致PCI术后老年患者发生慢复流，因此IL－33/ST2信号通路可能参与PCI术后慢复流的发生。

〔关键词〕经皮冠状动脉介入; IL－33/ST2信号通路

1右江民族医学院附属医院心血管内科

第一作者:蓝景生( 1969－)，男，博士，主任医师，主要从事心肌疾病炎症反应研究。

经皮冠状动脉介入( PCI)是治疗急性心肌梗死( AMI)的主要措施之一，但是，PCI术后仍有30%～40%患者出现无复流( NR)、慢复流( SR)现象，严重影响患者临床预后〔1〕。NR和SR可导致心肌梗死后更多发生充血性心力衰竭、恶性心律失常和心源性猝死等。冠心病是一种炎症和自身免疫性疾病，其病理基础是动脉粥样硬化( AS)，T细胞介导的免疫应答在AS的形成过程中起着重要的作用〔2，3〕。白细胞介素( IL)－33是一种前炎性细胞因子，可与ST2受体结合而启动IL－33/ST2信号传导通路，可调节机体炎症反应和免疫应答〔4，5〕。目前关于L－33/ST2信号通路与AMI老年患者PCI术后产生NR现象的相关研究较少。本文拟分析PCI术后SR患者IL－33/ST2信号通路表达及意义。

1资料与方法

1. 1一般资料2013年1月至2015年3月在本院心血管内科行PCI的210例患者，其中男116例( 55．24%)，女94例( 44．76%)，年龄60～81岁，平均( 63．67±8．64)岁。纳入标准:①缺血性胸痛持续时间＞30 min，并且舌下含服硝酸甘油未缓解;②血清肌酸激酶或肌钙蛋白升高＞正常上限2倍。排除标准:①有AMI史、冠状动脉支架或搭桥术史的患者;②发病时间＞24 h;③对造影剂过敏的患者;④有严重肝肾功能障碍及凝血功能障碍的患者;⑤有急慢性感染性疾病或免疫性疾病的患者;⑥研究者认为不适于参加本研究的患者。根据PCI术后心肌灌注分级分为SR组72例和正常血流组138例，以心肌灌注分级0～1级为SR，以2～3级为正常复流。

1. 2主要试剂与仪器Trizol试剂(美国Invitrogen公司) ;兔抗人IL－33抗体( Cloud－Clone Corp公司) ;兔抗人ST2抗体(美国Abcam公司) ;辣根过氧化物酶( HRP)标记的羊抗兔IgG(北京Trans Gen公司) ; PCR试剂盒及逆转录试剂盒、SYBR Green荧光定量PCR Mix(日本Taka Ra公司) ; EXL808全自动酶标仪(美国BIO－TEK公司) ; ABI 7300荧光定量PCR仪(美国ABI公司) ; GeneGenius全自动凝胶成像系统(美国Syngene公司) ; KodaK4000 MM显像系统(美国Carestream Health公司) ; 7070全自动生化分析仪(日本Hitachi公司) ; Volcano－s5血管内超声仪(美国Volcano公司) ; IL－33、ST2和GAPDH内参引物均由上海Generay Biotech公司合成，引物序列及产物长度见表1。

表1引物序列及产物长度

1. 3治疗方法所有入选患者术前检查后，立即给予患者阿司匹林300 mg、氯吡格雷300 mg双抗血小板治疗，并且应用他汀类药物降脂、低分子肝素钙抗凝、硝酸酯类药物扩冠等治疗。以右桡动脉或右股动脉为穿刺入路，按照标准冠脉内支架置入术施行PCI。PCI术后均给予常规治疗，严格卧床，持续动态心电监测，抗血小板聚集、抗凝、扩冠、降脂等治疗。

1. 4检测指标与方法所有入选患者在入院后行心电图检查，常规测量血压，抽取静脉血进行血糖、血脂等测定，并进行IL－33和ST2 mRNA和蛋白测定。

1. 4. 1血压、血脂和血糖的测定常规水银血压计测量收缩压和舒张压，血脂测定采用日立7070全自动生化分析仪，包括总胆固醇( TC)、甘油三酯( TG)、高密度脂蛋白( HDL)、低密度脂蛋白( LDL)。

1. 4. 2 IL－33和ST2 mRNA的测定外周血RNA采用Trizol试剂提取。沉淀细胞，裂解细胞，分离、沉淀、洗涤和溶解RNA，紫外分光光度计测定总RNA的A260 nm/A280 nm，1．5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。选择1．8～2．0并且无降解的RNA样品按反转录反应体系试剂盒说明合成cDNA。在冰上配制RNA逆转录反应体系: Prime Script TMRT Enzyme Mix 1 μl，5×Prime ScriptTM缓冲液4 μl，OligodT Primer 1 μl，总RNA 6．0 μl，随机引物1 μl，RNAse Freed H2O 7．0 μl，总反应体系20 μl。反应条件为37℃，15 min，再经85℃，5 s灭活反转录酶，获得cDNA样品。将cDNA产物扩增在实时荧光定量PCR仪上进行，RT－PCR反应按照试剂盒说明进行。反应条件: 95℃预变性15 min; 95℃变性30 s，62℃退火31 s，72℃延伸30 s，共40个循环。以2－ΔΔCt法计算Toll样受体( TLR) 2和TLR4 mRNA的表达量。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，然后Gene Genius全自动凝胶成像系统中扫描分析结果。

1. 4. 3 IL－33和ST2蛋白的测定外周血加入放射免疫沉淀法( RIPA)细胞裂解液，收集细胞，离心10 min，用预冷磷酸盐缓冲液( PBS)洗涤，超声切割30 s后4℃2 000 r/min离心10 min，采用聚氰基丙烯酸正丁酯( BCA)法测各组蛋白浓度。用细胞裂解液将各组蛋白稀释至等浓度，与上样缓冲液混合，煮沸10 min蛋白变性，每组取30 μg蛋白进行十二烷基酸钠聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离，将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜上，采用脱脂奶粉封闭，一抗孵育1 h，二抗室温孵育1 h，缓冲液洗膜3次，使用显色试剂盒对底物进行显色、定影。上述反应以β－actin作为内参照，结果用KodaK 4000 MM显像系统获取图像并测量条带灰度值，以目标蛋白与β－actin的比值作为各组产物相对表达值。

1. 5统计学方法采用SPSS18．0统计软件进行t检验，χ2检验，Logistic回归分析。

2结果

2. 1两组临床资料的比较两组年龄、性别、危险因素(高血压、糖尿病、血脂紊乱、吸烟比例)、收缩压( SBP)、舒张压( DBP)、血糖和HDL差异均无统计学意义( P＞0．05)，SR组TG、TC和LDL水平均较正常复流组显著升高( P＜0．01或P＜0．05)。见表2。

2. 2两组IL－33、ST2表达的比较SR组IL－33、ST2 mRNA和蛋白表达水平均较正常复流组显著升高( P＜0．01)。见表3。

表2两组临床资料的比较〔n( %)±s〕

表2两组临床资料的比较〔n( %)±s〕

分组n　　性别男女年龄(岁)　　危险因素高血压　　糖尿病　　血脂紊乱　　吸烟SR组　72　 38( 52．78)　34( 47．22)　 64．34±8．95　 33( 45．83)　16( 22．22)　45( 62．50)　19( 26．39)正常复流组138　 78( 56．52)　60( 43．48)　 63．04±7．59　 64( 46．38)　29( 21．01)　69( 50．00)　43( 31．16) t或χ2/P值　－　0．268/0．605　1．107/0．051　 0．006/0．940　 0．041/0．840　 2．979/0．084　 0．518/0．472分组　n　 SBP( mmHg)　 DBP( mmHg)　　血糖( mmol/L)　 TC( mmol/L)　 TG( mmol/L)　 LDL( mmol/L)　 HDL( mmol/L) SR组　72　 135．42±16．74　 88．60±13．70　 5．17±1．24　 4．95±1．21　 1．83±0．82　 3．34±0．82　 0．84±0．17正常复流组138　 137．74±17．53　 87．54±14．25　 5．08±1．19　 4．59±1．18　 1．52±0．75　 2．84±0．79　 0．86±0．20 t或χ2/P值　－　0．924/0．357　 0．518/0．605　 0．513/0．609　 2．080/0．039　 2．753/0．007　 4．297/0．000　 0．723/0．471

表3两组IL-33、ST2表达的比较(±s)

表3两组IL-33、ST2表达的比较(±s)

分组　n　IL－33ST2 mRNA　　蛋白mRNA　　蛋白SR组　72 0．84±0．12 1．14±0．24 0．59±0．08 0．79±0．11正常复流组　138 0．60±0．11 0．79±0．27 0．32±0．06 0．55±0．10 t值　　－　14．543　 9．254　 27．516　 15．947 P值　　－　0．000　 0．000　 0．000　 0．000

表4 PCI术后SR的多因素Logistic回归分析

2. 3 SR的多因素Logistic回归分析见表4。以PCI术后有无出现SR为因变量，将性别、年龄、高血压比例、糖尿病比例、血脂紊乱比例、患者吸烟比例、SBP、DBP、TG、TC、HDL、LDL、血糖、IL－33 mRNA、IL－33蛋白、ST2 mRNA和ST2蛋白进行多因素Logistic回归分析，结果显示TG、TC、LDL、IL－33 mRNA、IL－33蛋白、ST2 mRNA和ST2蛋白是PCI术后发生SR的危险因素。

3讨论

AMI是冠心病患者死亡的首要原因。AMI早期诊断和有效治疗对于降低死亡率有重要的临床意义。目前AMI主张积极、尽早进行冠脉再通治疗，PCI可以缩短心肌缺血时间，降低心肌梗死面积，保护心功能，改善临床预后。但随着介入治疗的开展，无/复流现象随之产生，最终导致不可逆的心肌坏死和心力衰竭。冠状动脉NR或SR现象的临床表现取决于PCI靶血管供血心肌的范围、患者心功能状态及非PCI靶冠状动脉病变的程度。近年来对“NR/SR”防治措施研究已成为国内外学者的热点研究课题之一，PCI后发生NR是院内死亡和心肌梗死的强独立预测因素〔6〕。冠状动脉NR/SR现象的发生机制尚不完全清楚，但粥样物质造成冠状动脉远端的微栓塞、心肌缺血再灌注损伤、毛细血管床的部分坏死及内皮功能障碍被认为是其发生的主要机制。

目前认为冠心病的发病过程也是一种炎症反应，是在体液调节的基础上，血液中细胞因子、趋化因子等共同作用的结果，同时也与免疫细胞的激活和失衡密切相关。IL－33属IL－1家族，主要在基质细胞中表达〔7〕。IL－33作为一种多效应细胞因子，能够多方面调节机体的免疫应答，其特异性受体是ST2〔8〕。ST2基因可编码至少3种不同的亚型，当心肌细胞受到机械或炎症刺激时，可以大量表达ST2。IL－33通过结合受体ST2后IL－33/ST2通路被激活后调节基因的转录，可促使Th1细胞向Th2细胞转化，可激活多种免疫细胞，促使Th2细胞分泌IL－4、IL－5、IL－13等〔9，10〕。IL－33/ST2通路与心力衰竭的相互关系在既往的许多研究中已经证实。IL－33/ST2信号通路参与了众多炎症反应性疾病的发展过程，提示这种通路也有可能对AS的发生发展及冠心病的发生发展有着重要的作用。本研究显示IL－33 mRNA、IL－33蛋白、ST2 mRNA和ST2蛋白是PCI术后发生SR的危险因素。IL－33和ST2表达水平升高可能导致PCI术后老年患者发生SR，因此IL－33/ST2信号通路可能参与PCI术后SR的发生。

4参考文献

1 Gibson CM，Sehomig A．Coronary and myocardial angiography: angiographic assessment of both epicardial and myocardial perfusion〔J〕．Circulation，2004; 109( 25) : 3096－105．

2粟英．超敏肌钙蛋白T和超敏C反应蛋白在心肌梗死老年患者血清中的表达及临床意义〔J〕．老年医学杂志，2013; 33( 3) : 645－6．

3 Methe H，Brunner S，Wiegand D，et al．Enhanced T－helper－1 lymphocyte activation patterns in acute coronary syndromes〔J〕．J Am Coll Cardiol，2005; 45( 12) : 1939－45．

4 Lefrancais E，Cayrol C．Mechanisms of IL－33 processing and secretion: differences and similarities between IL－1 family members〔J〕．Eur Cytokine Netw，2012; 23( 4) : 120－7．

5 Oboki K，Ohno T，Kajiwara N，et al．IL－33 and IL－33 receptors in host defense and diseases〔J〕．Allergol Int，2010; 59( 2) : 143－60．

6 Rennic FS，Waninstein M，Lee MK，et al．No－reflow is an independent predictor of death and myocardial infarction after percutaneous coronary intervention〔J〕．Am Heart，2003; 145( 1) : 42－6．

7 Miller AM，Liew FY．The IL－33 /ST2 pathway－A new therapeutic target in cardiovascular disease〔J〕．Pharmacol Ther，2011; 131( 2) : 179－86．

8 Lim EJ，Torresi J．Prevention of hepatitis C virus infection and liver cancer 〔J〕．Recent Results Cancer Res，2014; 193: 113－3．

9 Milovanovic M，Volarevic V，Radosavljevic G，et al．IL－33/ST2 axis in inflammation and immunopathology〔J〕．Immumol Res，2012; 52 ( 12) : 89－99．

10 Tu X，Nie SF，Liao YH，et al．The IL－33－ST2L pathway is associated with coronary artery disease in a Chinese Han population〔J〕．Am J Hum Gen，2013; 93( 4) : 652－60．

〔2014－12－16修回〕

(编辑苑云杰)

基金项目:广西自然科学基金( No．0640201)

〔中图分类号〕R541. 4

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202( 2016) 02-0312-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 026