那可丁联合顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞增殖及凋亡的影响

申　薇　梁冰锋秦金金　李秋颖　付雪莲　程建新(河北医科大学第四医院妇产科，河北　石家庄　0500)



那可丁联合顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞增殖及凋亡的影响

申薇梁冰锋1秦金金李秋颖付雪莲程建新
(河北医科大学第四医院妇产科，河北石家庄050011)

〔摘要〕目的探讨那可丁联合顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞的增殖抑制和凋亡的影响，并探讨其可能机制。方法体外培养人卵巢癌SKOV3细胞;用四甲基耦氮唑蓝( MTT)法检测SKOV3细胞增殖情况，流式细胞术检测分析细胞的周期变化、凋亡率及细胞中S期激酶关联蛋白2 ( Skp2)与成纤维细胞生长因子－2( FGF－2)的表达情况。结果在一定范围内，那可丁对SKOV3细胞的增殖有明显抑制作用，且存在着浓度和时间依赖效应( P＜0．05)。联合用药组SKOV3细胞凋亡率〔( 36．45±3．06) %，( 39．56±4．91) %〕高于顺铂组〔( 28．25±3．40) %〕( P＜0．05) ;与对照组相比，SKOV3细胞G0/G1期细胞比例减少( P＜0．05)，G2/M期细胞比例增加( P＜0．05) ;各用药组SKOV3细胞中Skp2和FGF－2的表达水平均低于对照组( P＜0．05)，其中联合用药组又低于顺铂组( P＜0．05)。结论那可丁提高了顺铂对SKOV3细胞的敏感性，其与顺铂联用具有协同抗肿瘤作用。

〔关键词〕卵巢肿瘤;那可丁;顺铂; S期激酶关联蛋白2;成纤维细胞生长因子－2

1河北女子职业技术学院护理系

第一作者:申薇( 1980－)，女，主治医师，博士，主要从事妇科肿瘤诊治研究。

卵巢癌严重危害女性的生命健康〔1〕。目前，除手术治疗外，以铂类为基础的联合化疗是治疗卵巢癌的主要手段，然而由于化疗药物血液、神经等方面毒副作用以及化疗引起的多药耐药性，严重影响了药物的化疗效果和临床疗效，甚至出现化疗失败〔2～4〕。因此，有必要寻找新型、毒副作用低的化疗辅助药物用以改善铂类药物的耐药性，提高卵巢癌患者的生存率并改善其生活质量。那可丁是一种来自于鸦片的邻苯二甲酸异喹啉生物碱，结构与秋水仙碱相似，一直作为镇咳药使用。近年来，研究证实那可丁具有抗肿瘤活性，并且该药物与紫杉醇、阿霉素等药物具有协同抗肿瘤作用〔5，6〕。本研究检测那可丁与顺铂联用对细胞增殖、凋亡及S期激酶关联蛋白2( Skp2)与成纤维细胞生长因子－2( FGF－2)表达的影响。

1材料与方法

1. 1细胞株、试剂和仪器人卵巢癌SKOV3细胞株由河北医科大学第四医院科研中心提供。注射用顺铂购自山东齐鲁制药厂，那可丁、胰蛋白酶、碘化丙啶( PI)染液购自美国Sigma公司，PBS缓冲液、RPMI－1640培养液购自美国Gibco公司，二甲基亚砜( DMSO)购自天津化学试剂厂，胎牛血清购自杭州四季青公司，四甲基耦氮唑蓝( MTT)购自洛阳华美生物工程公司，Skp2和FGF－2兔抗人单克隆抗体购自美国Epitomics公司。流式细胞仪，Epics－XLⅡ型，美国Beckman Coulter公司;酶标仪，HT2－125500型，郑州博赛生物工程公司。

1. 2方法

1. 2. 1细胞的培养与分组将人卵巢癌SKOV3细胞于37℃、5%CO2培养箱内，以含10%胎牛血清的RPMI－1640培养液在培养瓶内单层传代培养，取对数生长期细胞进行实验。实验分为:只加生理盐水的对照组;单用那可丁( 5、10、20、40、80、160 μmol/L)组;单用顺铂( 10 μg/ml)组;那可丁与顺铂联合应用(那可丁20 μmol/L +顺铂10 μg/ml，那可丁40 μmol/L +顺铂10 μg/ml)组。

1. 2. 2 MTT法检测细胞增殖抑制率取对数生长期的SKOV3细胞，用0．25%胰蛋白酶消化，调整细胞密度为2．5× 104个/ ml，接种于96孔培养板中，200 μl/孔(含5×103个细胞)，每组设3个平行孔。细胞分别加药培养24、48和72 h后，加入MTT( 5 mg/ml) 20 μl/孔，继续培养4 h。弃去上清液，加入DMSO( 200 μl/孔)，振荡10 min使结晶充分溶解。用酶标仪测其在490 nm波长处的吸光度( OD)值，按以下公式计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率( %) = ( 1－实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1. 2. 3流式细胞术检测细胞周期及凋亡率取对数生长期的SKOV3细胞，培养48 h后收集细胞，用无菌冷PBS离心洗涤3次，轻轻振荡后，加70%酒精固定，4℃保存过夜。PBS离心洗涤细胞3次，调整细胞浓度为1×106个/ml，取1 ml细胞悬液，向其中加入PI染液，使其终浓度达到50 μg/ml PI，4℃避光染色30 min后上流式细胞仪检测。分别应用Muticycle AV软件和Expo ADC软件对细胞周期的时相分布和细胞凋亡情况进行分析。

1. 2. 4流式细胞术检测细胞的蛋白表达取对数生长期的SKOV3细胞，培养48 h后收集细胞，用无菌冷PBS离心洗涤3次，轻轻振荡后，加70%酒精固定，4℃保存过夜。用PBS离心洗涤细胞2次，沉淀细胞后溶于100 μl PBS，分别加入Skp2和FGF－2兔抗人单克隆抗体100 μl，避光静置60 min，加入鼠抗兔二抗工作液100 μl，对照组只加二抗。避光静置60 min，流式细胞仪检测SKOV3细胞中蛋白的表达量，以平均荧光强度表示蛋白的含量。

1. 3统计学方法采用SPSS13．0软件行方差分析，两两组间比较采用LSD法。

2结果

2. 1那可丁对卵巢癌SKOV3细胞的增殖抑制作用随着药物浓度的增加，细胞的增殖抑制率总体呈增高趋势( P＜0．05)，但那可丁剂量组中40、80、160 μmol/L组间比较无显著差异( P＞0．05)。那可丁作用于SKOV3细胞24、48、72 h的IC50值分别为46．77、22．66、19．08 μmol/L，随着作用时间的延长那可丁对SKOV3细胞的增殖抑制作用明显增强( P＜0．05)，见表1，表明那可丁对SKOV3细胞的抑制存在时间和浓度依赖效应。

表1那可丁作用于SKOV3细胞的增殖抑制率(±s，%，n=3)

表1那可丁作用于SKOV3细胞的增殖抑制率(±s，%，n=3)

与5 μmol/L那可丁组比较: 1) P＜0．05;与10 μmol/L那可丁组比较: 2) P＜0．05;与20 μmol/L那可丁组比较: 3) P＜0．05

那可丁(μmol/L)　 24 h　48 h　72 h 5　11．73±11．71　 15．44±9．36　 17．60±8．21 10　17．11±14．13　 20．97±13．371)　26．46±12．051)20　32．03±15．30　 37．82±9．901) 2)　40．62±4．221) 2)40　 60．59±12．281) 2) 3)　76．51±9．341) 2) 3)　88．83±3．631) 2) 3)80　 61．55±7．861) 2) 3)　88．10±2．641) 2) 3)　92．22±1．341) 2) 3)160　 61．45±5．761) 2) 3)　89．10±2．061) 2) 3)　93．91±1．001) 2) 3)

2. 2那可丁、顺铂及联合应用对SKOV3细胞凋亡的影响与对照组相比，各用药组SKOV3细胞的凋亡率均显著增加( P＜0．05)，其中联合用药组又明显高于那可丁单药组及顺铂组( P＜0．05)。那可丁单用时，高剂量组高于低剂量组( P＜0．05)，见表2，表明那可丁与顺铂有协同诱导凋亡作用。

2. 3那可丁、顺铂及联合应用对SKOV3细胞周期的影响与对照组比，那可丁单药组和联合用药组G0/G1期细胞比例减少，G2/M期细胞比例增加( P＜0．05)。随着那可丁浓度的增加，G0/G1期细胞比例逐渐减少，G2/M期细胞比例逐渐升高，那可丁单剂量组和联合用药组内比较有显著差异( P＜0．05)。那可丁单药组和联合用药组G2/M期细胞比例显著高于顺铂组( P＜0．05)，表明那可丁对SKOV3细胞具有G2/M期阻滞作用。见表2。

2. 4那可丁、顺铂及联合应用对SKOV3细胞Skp2和FGF－2蛋白表达的影响与对照组相比，各用药组Skp2和FGF－2蛋白表达均降低( P＜0．05)。那可丁单用时，高剂量组Skp2和FGF－2蛋白表达低于低剂量组( P＜0．05)。联合用药组Skp2和FGF－2蛋白表达显著低于顺铂组( P＜0．05)，见表3。

表2卵巢癌SKOV3细胞凋亡及周期的变化(±s，%，n=3)

表2卵巢癌SKOV3细胞凋亡及周期的变化(±s，%，n=3)

与对照组比较: 1) P＜0．05;与顺铂组比较: 2) P＜0．01;与20 μmol/L那可丁组比较: 3) P＜0．05;与20 μmol/L那可丁+顺铂组比较: 4) P＜0．05

组别细胞周期G0/G1期　S期　G2/M期　细胞凋亡率对照组　61．77±4．97　21．36±3．61　16．87±2．65　2．87±0．94顺铂组　50．12±10．76　48．03±10．77　1．85±0．25　28．25±3．401)20 μmol/L那可丁组　50．73±2．661)　26．67±2．78　22．53±2．531) 2)　10．59±2．991)40 μmol/L那可丁组　31．77±9．381) 3)　36．27±10．87　32．00±1．801) 2) 3)　19．67±4．011) 3)20 μmol/L那可丁+顺铂组　27．47±5．771)　35．70±11．44　37．17±6．661) 2)　36．45±3．061) 2)40 μmol/L那可丁+顺铂组　6．55±4．591) 4)　38．37±6．95　55．10±6．361) 2) 4)　39．56±4．911) 2)

表3卵巢癌SKOV3细胞中Skp2和FGF-2蛋白的表达(±s，n=3)

表3卵巢癌SKOV3细胞中Skp2和FGF-2蛋白的表达(±s，n=3)

与对照组比较: 1) P＜0．05;与20 μmol/L那可丁组比较: 2) P＜0．05;与顺铂组比较: 3) P＜0．05

组别　Skp2　FGF－2对照组　167．12±7．01　 287．05±10．55顺铂组　141．58±8．541)　260．57±9．231)20 μmol/L那可丁组　151．56±6．191)　268．78±7．561)40 μmol/L那可丁组　134．12±7．331) 2)　250．72±5．211) 2)20 μmol/L那可丁+顺铂组　125．45±3．721) 3)　242．25±4．931) 3)40 μmol/L那可丁+顺铂组　113．75±7．211) 3)　227．62±6．151) 3)

3讨论

作为一种微管抑制剂，那可丁通过抑制微管动态不稳定性、干扰肿瘤细胞有丝分裂来抑制肿瘤细胞的增殖〔7〕，从而达到抗肿瘤的作用。那可丁不仅可以抑制非小细胞肺癌、神经胶质细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌等多种癌细胞的增殖，而且对一些紫杉醇耐药细胞也有较好的抑制作用，其作用机制目前尚不清楚，可能与抑制G2/M期有丝分裂及激活c－jun－氨基末端激酶( c－JNK)、p21参与、核转录因子( NF)－κB信号通路调节、半胱天冬氨酸酶( caspase)级联反应、B细胞淋巴瘤/白血病－2( Bcl－2)下调等途径有关。相关动物实验表明，采用口服、注射等不同的给药方式，那可丁对心、胸腺、十二指肠、肾、血液和骨髓等器官或组织没有明显的毒副作用，且与联合药品不产生交叉耐药〔8，9〕。本研究结果显示，那可丁可明显抑制SKOV3细胞增殖，并呈剂量和时间的依赖性。那可丁与顺铂联用可将SKOV3细胞阻滞于G2/M期，并增加SKOV3细胞的凋亡率，表明那可丁与顺铂联用具有协同抗肿瘤作用。

耐药的产生与肿瘤细胞一些蛋白的高表达密切相关，Skp2 与FGF－2均是耐药相关的蛋白，与肿瘤的发生、浸润、转移以及复发密切相关。Skp2是蛋白降解过程中特异的识别底物，介导降解其泛素化，主要调节细胞从细胞周期的G0/G1期进入到S期。它的过表达会导致细胞不断的进行细胞周期，使本应生理性凋亡的细胞不停地进行分裂，促进了基因的复制和细胞增殖〔10，11〕。FGF－2储存于肿瘤微环境的细胞外基质和间质细胞中，在细胞周期的转换中诱导并促进G0/G1期细胞进入S期，促使纤维细胞、上皮细胞和血管内皮细胞的快速增殖与分化。FGF与受体结合形成的二聚体发生磷酸化，可激活自身内在的酪氨酸蛋白激酶活性，活化磷脂酶C－蛋白激酶C( PLC－PKC)、磷脂酰肌醇3激酶－蛋白激酶B( PI3K－PKB)等多种不同的信号转导通路，促进新生血管生成和正常细胞恶性转化等多种生物学行为〔12〕。本研究结果显示，那可丁可明显降低SKOV3细胞中Skp2和FGF－2蛋白的表达量，提示那可丁可能通过抑制肿瘤组织中Skp2和FGF－2蛋白的表达，从而诱导卵巢癌细胞凋亡。总之，那可丁能抑制人卵巢癌SKOV3细胞的生长，且与顺铂联合应用对细胞的生长抑制具有协同作用，提示那可丁可考虑作为化疗药物顺铂的辅助用药，为改善卵巢癌患者的化疗效果，寻求新的临床治疗方案提供实验依据。

4参考文献

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8戴厚玲，郑剑斌，林敏，等．那可丁衍生物合成及其作为微管干扰药物的生物学评估〔J〕．药学学报，2012; 47( 10) : 1347－57．

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12 Upadhyay D，Panduri V，Kamp DW．Fibroblast growth factor－10 prevents asbestos－induced alveolar epithelial cell apoptosis by a mitogen－activated protein kinase－dependent mechanism〔J〕．Am J Respir Cell Mol Biol，2005; 32( 3) : 232－8．

〔2014－06－15修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

《中国老年学杂志》被国际数家数据库、检索性期刊检索机构收录情况

根据国际检索机构给中国科学技术期刊编辑学会国际交流工作委员会、中国高等学校自然科学学报研究会对外联络委员会发来的电子邮件及其附件统计整理，《中国老年学杂志》2009年又被4种国际重要检索系统列为来源期刊: 1)美国化学文摘( CA)，CODEN ZLZHAO，http: / /www．lib．dlut．edu．cn/layersec．asp; 2 )波兰《哥白尼索引》( IC，Index of Copernicus )，http: / / journals．indexcopernicus．com/karta．Php; 3)日本《科学技术社(中国文献数据库)》( JST，Japan Science＆Technology Agency) ( Chinese Bibliographic Database) ; 4)美国《乌利希期刊指南》( UPD，Ulrich's Periodicals Directory)，http: / /www．ulrichsweb．com/ ulrichsweb/5)美国《剑桥科学文摘:生物科学》( CSA: BS)。

·心、脑血管及代谢性疾病·

〔中图分类号〕R737. 31

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202( 2016) 02-0303-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 023