人胎盘组织液对自然衰老大鼠海马区细胞凋亡和氧化应激的影响

刘师兵　徐　冶　于　洋　李松岩　张国昊陈　彤高　磊(吉林医药学院基础医学院医学科研实验室，吉林　吉林　3203)



人胎盘组织液对自然衰老大鼠海马区细胞凋亡和氧化应激的影响

刘师兵徐冶于洋李松岩张国昊1陈彤1高磊1
(吉林医药学院基础医学院医学科研实验室，吉林吉林132013)

〔摘要〕目的探讨人胎盘组织液对自然衰老大鼠大脑海马区凋亡相关蛋白及氧化应激水平的影响及人胎盘组织液的抗衰老作用。方法将雄性SD大鼠平均分为四组，每日分别腹腔注射生理盐水和低、中、高剂量的人胎盘组织液，连续注射24 w。应用HE染色、脂褐素染色、免疫组化技术检测脑组织超氧化物歧化酶( SOD)活性和丙二醛( MDA)含量，观察人胎盘组织液对Bcl－2、Bax蛋白表达量以及Bcl－2/Bax比例的变化，以及对衰老大鼠大脑细胞氧化自由基损伤的影响。结果模型组大鼠大脑海马区Bax蛋白及脂褐素表达量明显高于用药组，Bcl－2蛋白表达量明显降低;模型组SOD值低于用药组，MDA值高于用药组。结论人胎盘组织液能通过提高组织抗氧化能力和减少细胞凋亡从而延缓衰老。

〔关键词〕人胎盘提取液;海马神经元; Bcl－2; Bax

1吉林医药学院临床医学院

第一作者:刘师兵( 1982－)，女，助理实验师，主要从事形态学和病理学研究。

人胎盘，又名紫河车。在我国中医史上，早就有关于其入药、保健方面的记载。《本草拾遗》中记载:“主气血羸瘦，妇人劳损，面黩皮黑，腹内诸病渐瘦悴者。”认为其具有补肾益精，益气养血之功。现在医学研究表明，人胎盘具有抗疲劳、耐缺氧、抗氧化和免疫调节等方面的作用〔1〕。本实验拟研究人胎盘组织液的抗衰老和抗氧化作用。

1材料与方法

1. 1药品和试剂人胎盘组织液:购自康业制药有限公司，国药准字S13020002;兔抗Bcl－2多克隆IgG抗体、兔抗Bax多克隆IgG抗体:购自北京中杉金桥生物技术有限公司;兔免疫组化试剂盒:购自福建迈新生物技术开发有限公司;脂褐素染色液:购自北京雷根生物技术有限公司;超氧化物歧化酶( SOD)检测试剂盒、丙二醛( MDA)测定试剂盒:购自南京建成生物工程研究所。

1. 2动物清洁级健康雄性SD大鼠60只，体重( 220±10) g，购自吉林大学基础医学院动物室。

1. 3仪器日本奥林巴斯FV1000型激光扫描共聚焦显微镜;德国Leica RM2245型石蜡切片机;德国Leica DM1000型显微镜;超声波粉碎机:宁波新芝生物技术股份有限公司。

1. 4实验方法

1. 4. 1实验动物模型将60只雄性SD大鼠随机平均分为模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。常规饲养48 w后，模型组大鼠1次/d腹腔注射0．4 ml生理盐水，低、中、高剂量组分别给予1次/d腹腔注射0．1 ml、0．2 ml和0．4 ml的人胎盘组织液。造模时间为24 w。

1. 4. 2组织取材三组大鼠行3%二氟二氯乙基甲醚吸入麻醉后，断头取大脑，大脑左半球做组织匀浆，右半球浸入4%多聚甲醛溶液中固定48 h以上。

1. 4. 3苏木素－伊红( HE)染色取大鼠大脑右半球组织脱水、透明、石蜡包埋，连续4 μm石蜡切片，烤片、脱蜡后行HE染色，镜下观察并扫描图像。使用光学显微镜观察海马CA1、CA2、CA3及齿状回的细胞形态排列和数量变化，扫描图像后各组间进行比较。

1. 4. 4脂褐素染色石蜡切片脱蜡至水，清洗后滴加复红染色液室温过夜，清洗后分化、复染细胞核，常规脱水、透明、封片。

1. 4. 5免疫组化取各组石蜡切片各2张，脱蜡、复水，滴加3%H2O2灭活组织中内源性过氧化物酶的活性;柠檬酸热修复;按试剂盒说明书进行冲洗、血清封闭、各组分别滴加Bcl－2 和Bax，抗体的稀释浓度均为1∶100。二氨基联苯胺( DAB)显色后，苏木素复染细胞核，常规脱水、透明、封片。使用光学显微镜观察海马区Bcl－2和Bax蛋白表达和脂褐素染色情况，每只大鼠取1张切片扫描图像，分别做积分光密度分析。

1. 4. 6大鼠大脑组织SOD活性、MDA含量检测处死大鼠后迅速剥离脑组织，取大脑左半球准确称重，按重量体积比1∶9加4℃生理盐水制成组织匀浆液，进行蛋白标定后，严格按照南京建成生物工程研究所试剂盒操作步骤测定SOD活性和MDA含量。

1. 5统计学方法应用SPSS19．0软件行方差分析。

2结果

2. 1 HE染色结果光镜下观察，模型组大鼠海马CA1区锥体细胞形态和排列改变极为明显，排列疏松紊乱，细胞脱失明显，胞体变形，细胞核固缩。与模型组相比，低、中、高剂量组相应区域锥体细胞脱失现象均有所改善。高剂量组大鼠相应区域的细胞形态和排列改善最为明显，锥体细胞排列整齐，形态较完整。见图1。

2. 2脂褐素染色结果各组大鼠海马区及大脑皮层均有大小不等、数量不一的脂褐素表达区域，尤其在大脑皮层区的表达更最明显，表现为中空形或颗粒形的大小不一的褐色色素沉着。镜下观察，模型组大脑皮层脂褐素分布密集且颜色更深;低、中、高剂量组大脑皮层脂褐素分布比模型组明显减少，高剂量组脂褐素分布最为松散，且数量最少，染色较浅。统计学显示，模型组脂褐素表达的积分光密度数值明显高于低、中、高剂量组。见图2，表1。

图1各组自然衰老大鼠CA1区HE染色结果(×200)

图2各组自然衰老大鼠大脑皮层脂褐素表达结果( DAB，×200)

2. 3 Bcl－2蛋白表达结果Bcl－2蛋白表达在细胞膜内和胞质中，DAB显色后呈褐色。各组大鼠海马CA1、CA2、CA3及齿状回均有阳性表达。模型组的Bcl－2蛋白阳性表达减少，低、中、高剂量组Bcl－2蛋白的阳性表达明显增强;高剂量组阳性表达的细胞数量更多、着色更重，并且分布密集。见图3，表1。

2. 4 Bax蛋白表达结果Bax蛋白在各组大鼠海马CA1、CA2、CA3及齿状回细胞的细胞膜内和胞质中均有阳性表达。高剂量组有散在阳性表达，但表达强度和数量明显少于模型组;低剂量组和中剂量组阳性表达均有增多;模型组Bax蛋白阳性分布密集，数量明显增加，且着色更深。见图3，表1。

2. 5各组大鼠大脑组织SOD活性、MDA含量检测结果见表2。模型组SOD值低于用药组，MOA值高于用药组( P＜0．05)。

表1各组海马CA1区脂褐素、Bcl-2和Bax蛋白阳性表达积分光密度值(±s，n=15)

表1各组海马CA1区脂褐素、Bcl-2和Bax蛋白阳性表达积分光密度值(±s，n=15)

与模型组比较: 1) P＜0．05;与低剂量组比较: 2) P＜0．01;与中剂量组比较: 3) P＜0．01;下表同

组别　　脂褐素　Bcl－2蛋白　Bax蛋白　Bcl－2/Bax模型组　88．51±4．03　 39．12±3．61　 108．43±3．22　 0．36低剂量组　63．21±3．21　 53．51±4．07　 89．76±4．07　 0．59中剂量组42．39±3．031) 2)65．30±3．541) 2)67．45±3．351) 2)　0．96高剂量组33．47±2．252) 3)70．30±3．502) 3)54．22±4．282) 3)　1．29

图3各组自然衰老大鼠CA1区Bcl-2、Bax蛋白表达结果( DAB，×200)

表2各组大鼠大脑组织SOD活性、MDA含量(±s，n=15)

表2各组大鼠大脑组织SOD活性、MDA含量(±s，n=15)

组别　SOD活性( U/mg)　 MDA含量( nmol/mg)模型组　27．6±3．2　4．24±0．32低剂量组　31．4±3．6　3．58±0．54中剂量组　39．5±3．51) 2)　3．12±0．241) 2)高剂量组　48．9±2．32) 3)　2．33±0．402) 3)

3讨论

衰老是生物体在生命后期阶段出现的全身性、进行性、多因素共同作用的循序渐进的退化过程〔2〕。研究表明，细胞凋亡和氧化自由基的大量生成与哺乳动物衰老有着密切的关系〔3〕。脑组织是体内氧负荷最大的器官之一，与衰老的相关性很高。传统中医药发现哺乳动物胎盘提取物质具有“延年益寿”的抗衰老功效，同时认为其具有清除氧化自由基的作用〔4〕。但对人胎盘提取物的报道并不多见。

Bcl－2和Bax是同家族蛋白，功能却相反。Bcl－2蛋白属于抗凋亡蛋白，通过其编码蛋白发挥调控作用。有研究表明，当Bcl－2蛋白大量表达时，可具有抗氧化或抑制氧自由基产生的作用，从而抑制细胞凋亡〔5〕。Bax蛋白属于促凋亡蛋白，当其过量表达时，可自身结合成同源二聚体促进凋亡的发生。细胞Bcl－2/Bax比值是判定细胞凋亡促进或抑制状态的重要指标〔6〕。本实验结果显示，人胎盘组织液能够使Bcl－2蛋白增多，抑制Bax蛋白对细胞凋亡的促进作用。

自由基可以直接或间接地发挥强氧化作用，极易侵害细胞膜中的不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化反应，形成氧化脂质。脂质过氧化物的降解产物MDA可与游离氨基反应形成脂褐素，积蓄在细胞质中，引起机体衰老〔7〕。光学显微镜下观察，脂褐素为1～3 μm的棕色颗粒，有的可呈现多叶性大颗粒，有的具有中空结构〔8〕。根据本实验结果推测人胎盘组织液能够干预自由基的氧化反应，且具有效量关系。

SOD是机体内重要的抗氧化酶，是生物体内清除自由基的首要物质，对机体氧化系统和抗氧化系统平衡起着重要的作用，SOD在生物体内的水平高低直接反映机体的抗氧化能力〔9〕。MDA是脂质过氧化反应的产物，可反映脑组织过氧化反应的情况，间接反映出不同组别大脑细胞衰老损伤的程度〔10〕。本实验结果表明，人胎盘组织液具有清除体内氧化自由基、抑制氧化损伤的抗氧化作用。

综上所述，通过使用人胎盘组织液，能够使大鼠大脑中抗凋亡细胞蛋白增多、促凋亡细胞蛋白减少，能够减轻机体内氧化自由基反应从而达到延缓衰老的目的。

4参考文献

1杨桂芹，邹兴淮．胎盘及其提取物的化学成分、药理作用及临床应用研究进展〔J〕．沈阳农业大学学报，2003; 34( 2) : 150－4．

2 Wheeler HE，Kim SK．Genetices and genomics of human ageing〔J〕．Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2011; 366( 1561) : 43－50．

3 Limoli CL，Kaplan MI，Giedzinski E，et al．Attenuation of radiation－induced genomic instability by free radical scavengers and cellular proliferation〔J〕．Free Radic Boil Med，2001; 31( 1) : 10．

4刘芝兰．自由基与衰老及延缓衰老药物干预〔J〕．临床心身疾病杂志，2005; 11( 2) : 192－3．

5 Voehringer DW，Meyn RE．Redox aspects of Bcl－2 function〔J〕．Antioxid Redox Signal，2000; 2( 3) : 537－50．

6 Huang X，Choi JK，Park SR，et al．GM－CSF inhibits apoptosis of neural cell via regulating the expression of apoptosis－related proteins〔J〕．Neurosci Res，2007; 58( 1) : 50－7．

7李素云，王立芹，郑稼琳，等．自由基与衰老的研究进展〔J〕．中国老年学杂志，2007; 27( 10) : 2046－8．

8赵增翰．脂褐素的研究及其进展〔J〕．国外医学:老年医学分册，1981; 4: 145－9．

9 Li XM，Ma YL，Liu XJ．Effect of the lycium barbarum polysaccharides on age－related oxidative stress in aged mice〔J〕．J Ethnopharmacol，2007; 111 ( 3) : 504－11．

10 Pal R，Vaiphei K，Sikander A，et al．Effect of garlic on isoniazid and rifampicin－induced hepatic injury in rats〔J〕．World J Gastroenterol，2006; 12( 4) : 636－9．

〔2015－05－11修回〕

(编辑袁左鸣)

通讯作者:徐冶( 1972－)，男，教授，硕士生导师，主要从事老年医学和肿瘤学研究。

基金项目:吉林省教育厅“十二五”科学技术项目(吉教科合字〔2014〕第552号)

〔中图分类号〕R339. 3

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202( 2016) 02-0282-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 012