木糖对产油假丝酵母油脂积累的影响

刘秀花， 孔冠楠， 王莉， 宋兆齐，梁峰

(商丘师范学院 生物精炼河南省工程实验室，河南 商丘， 476000)



木糖对产油假丝酵母油脂积累的影响

刘秀花， 孔冠楠， 王莉， 宋兆齐，梁峰

(商丘师范学院 生物精炼河南省工程实验室，河南 商丘， 476000)

摘要：微生物利用纤维质材料生产生物燃料具有重要的意义.本实验对实验室分离、筛选的一株产油假丝酵母进行了油脂积累随时间变化的观察及木糖对菌体油脂积累影响研究.结果表明以40 g/L的葡萄糖为碳源时，假丝酵母细胞内油脂随时间变化先增加后减少；用不同浓度木糖代替葡萄糖，葡萄糖与木糖不同比例时碳源消耗均较大，而生物量则在碳源全为木糖时相对较少，细胞含油率在纯木糖时却最高，达到43.5%.因此木糖为碳源有利于假丝酵母油脂积累，可用此菌进行玉米芯降解液的发酵.

关键词：假丝酵母；木糖；糖消耗；生物量；油脂百分率

人类社会面临化石能源枯竭、温室气体严重超标、环境污染严重等全球问题，新能源的开发是解决目前严重问题的最理想的方法，绿色能源近年来生物领域的研究发展迅速，尤其是发现一些藻类、霉菌、酵母菌、细菌均存在产油菌种，粘红酵母属产油菌株中油脂含量最高的,能达到72%[1]，将生成的油脂转换成生物柴油不仅有助于缓解能源问题，而且无污染；微生物油脂多是中性脂，并且微生物菌体如霉菌、酵母菌等有发酵周期短，易大批量生产，并可利用秸秆酸解液[2]进行废物利用，实现能源再生而成为研究热点.本实验研究假丝酵母利用葡萄糖积累油脂过程观察，并探究假丝酵母利用木糖积累油脂的特征.

1材料与方法

1.1研究材料

供试菌种菌种，假丝酵母菌B(CandidaalbicanB).PDA培养基用于菌种活化和保存.GMY液体培养基，每升含磷酸二氢钾8 g， 七水合硫酸镁0.5 g， 酵母膏3 g，单糖40 g(葡萄糖或/和木糖)，pH5.5.

1.2研究方法

1.2.1苏丹黑染色法与菌体内油脂观察

每24 h取出1 mL菌液于1.5 mL离心管进行离心后加入0.5 mL苏丹黑染液，混合均匀后静置染色1 h，离心去染液，加水清洗，加70%酒精清洗一次，再加水清洗离心后用无菌水悬浮，进行水装片观察[3].

1.2.2还原糖含量测定

还原糖含量采用DNS法[4].

1.2.3菌体生物量测定

将发酵完成的菌液4000 r/min离心5 min，收获菌体，并无菌水洗3次，放入-20℃冷冻2 h，在冷冻干燥机中冻干24 h，取出用已恒重的称量瓶称重.

1.2.4油脂提取、油脂含量测定

提取油脂采用热酸解法[5].含量测定采用质量分析法，将提取的油脂用石油醚和乙醚转移到小烧杯中，在105℃烘干箱中烘干2 h，放入干燥器中0.5 h后用分析天平称重，反复几次直到差值不超过0.01 g，利用烧杯装油前后差值计算油重.

1.2.6菌体培养

用250 mL三角瓶分装GMY液体培养基100 mL，经灭菌后接种，24 h种子培养后，再以10的接种量转接新鲜培养基内，28 ℃，180 rpm条件下培养，不同时间点取菌体进行显微观察优质积累情况，并收获菌体用于生物量分析和忧患量分析.

2结果与分析

2.1菌体内油脂积累过程及发酵液中残糖量变化

为了研究假丝酵母B利用葡萄糖积累油脂情况，从液体培养第1 d开始，采取苏丹黑染色法观察菌体油质积累情况，同时采用DNS法测定残糖，来跟踪观察油脂积累过程和残糖变化关系.如图1所示，深蓝色的部分是被苏丹黑染色的油脂，由图1可知菌体可呈现假丝状，芽殖.

图1　酵母菌体内油脂显微图片Figure 1　the micrographs of lipid body in yeast cells (A～H：1～8day)

从图1A到图1C可以看出，菌体由细长到个别体积变大，再到多个细胞体积变大；油脂从小块儿到几乎充满菌体，是一个菌体和油脂的生长过程.从图1D到图1F可以看出多数菌体被油脂几乎充满，油脂累积处在高峰.从图1G到图1H可以看出，膨大的菌体内部被染色的油脂颜色淡化，甚至消失，油脂被利用.

每天检测发酵液中残糖量，其变化如图2所示.由图2可知每升培养液中由最初的40 g，随培养时间的增加逐渐减少，培养到第3、4 d时，糖消耗近一半，到第7、第8否d近乎消耗完全.由图1和图2显示结果可知，综合菌体内油脂积累变化和发酵液中糖消耗量变化.在限氮基础培养基上，在菌株开始培养时油脂即开始积累，并随着碳源的消耗，在培养第3 d，碳源消耗近半时，菌体体积变大，油脂持续生长近乎充满菌体，在培养到5、6 d时，多数菌体体积增加，油脂近乎充满菌体，糖稳步消耗，油脂积累处在高峰期；最后在培养7、8 d时碳源消耗殆尽，菌体内油脂染色颜色开始变浅，菌体在培养基中糖不足时开始消耗体内积累脂类.

2.2木糖对假丝酵母积累油脂的影响

基于对玉米芯降解液进行发酵生产生物柴油的目的，用玉米芯降解物木糖作为碳源探究假丝酵母利用木糖对油脂积累的影响；设计实验是在限氮基础培养基上，碳源是葡萄糖与木糖比例为1∶0、1∶1、0∶1三组，考虑到生产周期不宜过长，以及节约经济成本，则每组均从第3 d开始收获菌体并提油直到第7 d为止研究残糖量、生物量及含油百分率的变化情况.

2.2.1不同木糖比残糖量随时间变化

基于此假丝酵母为工程菌，存在木糖代谢途径，即假丝酵母利用碳源转化为油脂，因此每天对发酵液中残糖量进行测定，结果如图3所示，在每组糖比例下，随时间增长，各组糖含量均在减少，减少趋势一致，消耗程度相当，即在总糖为40 g/L时，到第7 d时均消耗近半，说明此株酵母菌可同时利用木糖与葡萄糖用于生长代谢.

图2　残糖量随时间变化　　　　　　　　 图3 不同比例葡萄糖和木糖培养条件下残糖量随时间变化　　　　　　Figure 2 Residual sugar changes over time 　　　　　　　　　　 Figure 3　The change of sugar consumption over time

2.2.2不同木糖比例下对生物量的影响

假丝酵母利用葡萄糖和木糖生长繁殖，随着培养时间的增加，碳源不断消耗，菌体不断增多，生物量形成情况如图4所示，当碳源全为葡萄糖时，每天收获生物量均较多，葡萄糖∶木糖为1∶1时次之，当为全木糖时，收获生物量有明显差异，即最少.有图4显示，假丝酵母利用以上三组不同糖比例时，糖消耗不存在显著性差异，因此假丝酵母利用糖类除用于生长外，更多的用于其他代谢.

经F检验，三组不同糖比例下生物量收获从第3 d开始到第7 d，其中前两组是第4、5 d不存在显著性差异，但较第3 d有显著性差异；第6、7 d不存在显著性差异，但较第4、5 d有显著性差异；而第三组是，第3、4、5 d不存在显著性差异，第6、7 d亦不存在显著性差异，但第6、7 d较前3 d有显著性差异.说明葡萄糖存在时在前期生长有助于菌体快速增殖，而全木糖时，菌体增殖较慢.

2.2.3不同糖比例对细胞含油量影响

由于菌体利用营养物质除生长外，大部分碳源用于积累油脂，在不同木糖比例下，油脂积累情况如图5所示，由图5可知，油脂百分含量在三组糖比例中从1∶0到1∶1到0∶1呈现增长趋势，即当全为木糖时，每天相比较含油百分比均较高，在三组中油脂积累最好的时间第6 d时，全木糖的高达43.5%.另外，在前两组中第3、4 d含油百分比均较低，并不存在显著性差异，第5、6、7 d含油百分比达到高峰期，与前两天相比有显著性差异；而在第三组中第3 d含油百分比较低，从第4 d开始油脂积累较多，即第4、5、6、7 d较第3 d有显著性差异，且第6 d为最佳油脂积累时期，此时由图3、4可以看出糖消耗近半，生物量为5.6 g/L.

图4　三种条件下生物量随时间变化　　　　　　　　图5　不同糖比例菌体油脂百分率随时间变化Figure.4 The change of biomass over time in different 　　　　　　　Figure.5 The change of oil percentage of yeast over time in different 　　　　　　　proportion of sugar　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　proportion of sugar

3结论

此假丝酵母B油脂积累从对数生长期开始，在稳定期油脂积累一直处于上升状态，油脂在较长一段时期处于积累高峰期，菌体可利用性强，实验室其它实验验证在发酵条件是180 rpm，28 ℃，250 mL三角瓶中装液量50 mL，接种量10%，可使油脂积累达到50%；油脂产量达4.74 g/L；在用不同浓度木糖替代葡萄糖时，菌体仍生长良好，但却积累油脂百分比更高，并在最佳培养天数6 d时，油脂百分比高达43.5%.这在微生物能源方面有较好的发展前景，如利用一些农作物秸秆，食物残渣等一些难利用的生物质，经处理制成发酵液供给此菌体或其它一些真菌发酵产生油脂，并通过转酯反应生成柴油，可以缓解能源问题.

参考文献：

[1]Ratledge C, Wynn JP.The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginous microorganisms[J].Adv Appl Microbiol, 2002, 51: 1-51.

[2]方祥年,黄炜，夏黎明.假丝酵母发酵玉米芯半纤维素水解液生产木糖醇[J].生物工程学报，2004， 20(2):42-45.

[3]梁峰,王莉,夏保密,等.不同葡萄糖浓度对霉菌产有能力的影响[J].河南科技，2015,252(4):131-134.

[4]张龙翔.生化试验方法和技术[M].北京：人民教育出版社,1980:68-90.

[5]Bligh EG, Dyer WJ.A rapid method for total lipidextraction and purification[J].Can J Biochem Physiol, 1959, 37: 911-917.

[责任编辑：徐明忠]

Xylose impact on oil Candida lipid accumulation

LIU Xiuhua，KONG Guannan，WANG Li,SONG Zhaoqi,LIANG Feng

(Biorefinery Engineering Lab of Hena Province, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China)

Abstract:Microorganism use of cellulosic materials to produce biofuels has the vital significance.This experiment in laboratory, screening of strain isolated oil Candida for lipid accumulation of observation over time and xylose research effects on bacteria lipid accumulation.The results showed that 40 g/L glucose as carbon source, Candida yeast cells grease increase first and then decrease along with time variation; With different concentration of xylose do carbon source instead of glucose, glucose and xylose consumption were all bigger, and the biomass in carbon source for xylose is relatively small, all lipid percentage of cells in pure xylose was the highest, up to 43.5%.Therefore xylose do carbon source benefits Candida lipid accumulation, the bacteria for corncob degradation liquid fermentation are available.

Key words:Candida;xylose;sugar consumption;biomass;kipid percentage

中图分类号：O657.7

文献标识码：A

文章编号：1672-3600(2016)03-0048-04

作者简介:刘秀花(1963-)，女，河南新乡人，商丘师范学院教授，主要从事微生物资源、酶制剂、生物能源方面的研究.

基金项目：河南省重点科技攻关资助项目(No.132102310039、142102310044)

收稿日期：2015-12-23