鼻咽癌组织中MKK4蛋白表达变化及其与MKK4基因启动子区-1304 T/G多态性的关系

鲁明骞，孔庆志，许新华，卢宏达，赵华山，周刚，徐冰清，郭蓉

(1三峡大学第一临床医学院肿瘤防治中心，湖北宜昌443003；2武汉市中心医院)



鼻咽癌组织中MKK4蛋白表达变化及其与MKK4基因启动子区-1304 T/G多态性的关系

鲁明骞1，孔庆志2，许新华1，卢宏达2，赵华山1，周刚1，徐冰清1，郭蓉1

(1三峡大学第一临床医学院肿瘤防治中心，湖北宜昌443003；2武汉市中心医院)

目的观察鼻咽癌组织中丝裂原活化蛋白激酶激酶4(MKK4)蛋白的表达变化，并探讨其与MKK4基因启动子区-1304 T/G多态性的关系。方法 鼻咽癌患者90例，术中留取肿瘤组织和癌旁组织。采用免疫组化检测鼻咽癌组织和癌旁组织中的MKK4蛋白；采用PCR-限制性片段长度多态性法检测患者MKK4基因启动子区-1304 T/G位点单核苷酸多态性。结果 鼻咽癌组织中MKK4蛋白表达阳性68例(75.6%)、MKK4蛋白低表达26例(40%)、高表达54例(60%)，癌旁组织中MKK4蛋白表达阳性85例(94.4%)，MKK4蛋白低表达18例(20.0%)，高表达72例(80.0%)。MKK4蛋白在鼻咽癌组织中的表达明显低于癌旁组织(P<0.05)。鼻咽癌患者MKK4基因启动子区-1304 T/G为TT基因型16例(17.8%)，TG基因型51例(56.7%)，GG基因型23例(25.6%)，TG+GG基因型74例(82.2%)。MKK4蛋白低表达的36例中，MKK4基因启动子区-1304 TT基因型10例(27.8%)、TG基因型19例(52.8%)、GG基因型7例(19.4%)、TG+GG基因型26例(72.2%)；MKK4蛋白高表达的54例中MKK4基因启动子区-1304 TT基因型6例(11.1%)、TG基因型32例(59.3%)、GG基因型16例(29.6%)、TG+GG基因型48例(88.9%)。MKK4蛋白低表达者与高表达者MKK4基因启动子区-1304 T→G发生率相比，P<0.05。结论 鼻咽癌组织中MKK4蛋白阳性表达率降低，MKK4蛋白低表达可能与鼻咽癌发病有关；MKK4基因启动子区-1304 T→G突变者MKK4蛋白表达增高。

鼻咽癌；丝裂原活化蛋白激酶激酶4；基因启动子区；基因多态性

鼻咽癌是我国南方地区最常见的头颈部恶性肿瘤，发病率居头颈部恶性肿瘤的首位[1]。鼻咽癌的发生与遗传、EB病毒感染、环境等因素有关，多种信号转导通路参与了鼻咽癌的发生发展。丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，丝裂原活化蛋白激酶激酶4(MKK4)作为MAPK信号传导通路的构成部分，可调控细胞增殖、分化、凋亡过程及血管形成、肿瘤转移等过程[2～4]。单核苷酸多态性(SNP)是由于单个碱基的转换、缺失和插入，导致在某一人群基因组内特定核苷酸位置上出现不同的碱基[5]。SNP与多种恶性肿瘤的发生、发展有关[6]。SNP研究最为广泛的区域是启动子区域。目前研究表明MKK4启动子区-1304 T/G多态与多种恶性肿瘤关系密切，包括鼻咽癌。本研究观察了鼻咽癌组织中MKK4蛋白表达水平，并探讨其与MKK4基因启动子区-1304 T/G多态性的关系，为鼻咽癌的诊断和治疗提供相关理论依据。

1　资料与方法

1.1临床资料2002年1月～2009年12月入院治疗的鼻咽癌患者90例，其中男54例、女36例，年龄22～73(45.3±5.2)岁。全部患者均为初诊鼻咽癌，病灶位于咽隐窝70例、顶后壁20例。低分化鳞癌85例、未分化癌5例。Ⅰ、Ⅱ期53例、Ⅲ、Ⅳ期37例。所有患者行常规放射治疗，中晚期患者辅以DDP+5-FU诱导方案化疗。取活检术中留取的肿瘤组织和癌旁正常组织的石蜡标本；留取患者外周静脉血2 mL。

1.2MKK4蛋白检测将组织标本制备成4 μm厚的连续切片，经组织切片脱蜡、水化、高温高压抗原修复后，滴加MKK4单克隆抗体(1∶80)，4 ℃过夜后37 ℃复温45 min，PBS洗涤3次，滴加生物素化二抗，37 ℃ 20 min，PBS洗涤3次，滴加SABC试剂，37 ℃ 20 min，PBS洗涤4次，加DAB显色剂后显微镜观察。结果判定：MKK4蛋白阳性信号定位于细胞质，少数位于细胞核，呈棕黄色。根据Fromowitz综合评分法，用阳性细胞百分比与着色强度综合判定结果：阳性细胞百分比<5%计0分，5%～<25%计1分，25%～<50%计2分，50%～<75%计3分，≥75%计4分；细胞着色强度为无染色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；上述两项得分相乘，0～1判定蛋白表达阴性、≥2判定为蛋白表达阳性,0～2为低表达、≥3为高表达。

1.3MKK4基因-1304 T/G多态性观察 将患者血液离心后，提取冻血DNA，采用PCR-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)测定MKK4-1304 T>G(rs3826392)的基因型，上游引物序列为5′-GAAGATATTGGGCAGCCAAC-3′，下游引物序列为5′-CAGCCTTGCCTAAAATGGAA-3′。反应条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s(35个循环)适温延伸，72 ℃ 60 s，72 ℃ 10 min。用核酸内切酶Sml Ⅰ消化扩增好的片段，然后置于2%琼脂糖凝胶分离。

1.4统计学方法采用SPSS13.0统计软件。采用直接计数法计算基因型及等位基因频率。如果数据方差不齐，采用两独立样本的Wilcoxon秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

鼻咽癌组织中MKK4蛋白表达阳性68例(75.6%)，MKK4蛋白低表达26例(40%)，高表达54例(60%)。癌旁组织中MKK4蛋白表达阳性85例(94.4%)，MKK4蛋白低表达18例(20.0%)，高表达72例(80.0%)。MKK4蛋白在鼻咽癌组织中表达低于癌旁组织(P<0.05)。鼻咽癌患者MKK4基因启动子区-1304 T/G为TT基因型16例(17.8%)，TG基因型51例(56.7%)，GG基因型23例(25.6%)，TG+GG基因型74例(82.2%)。

MKK4蛋白低表达的36例中，MKK4基因启动子区-1304 TT基因型10例(27.8%)、TG基因型19例(52.8%)、GG基因型7例(19.4%)、TG+GG基因型26例(72.2%)；MKK4蛋白高表达的54例中MKK4基因启动子区-1304 TT基因型6例(11.1%)、TG基因型32例(59.3%)、GG基因型16例(29.6%)、TG+GG基因型48例(88.9%)。MKK4蛋白低表达者与高表达者MKK4基因启动子区-1304 T→G发生率相比，P均<0.05。

3　讨论

鼻咽癌是最常见的头部恶性肿瘤，近年来分子靶向药物的研发和应用为鼻咽癌的治疗带来了新的曙光。MKK4作为MAPK信号转导通路的重要组成部分，是癌基因Ras信号转导通路的中心环节，在肿瘤发生、发展中起重要调节作用[7]，能同时磷酸化并激活JNK通路和p38通路，将细胞外信号传导至细胞及其核内，引起相应的生物学反应。

既往研究[8～11]表明MKK4蛋白在多种恶性肿瘤组织中均有表达，其表达程度越高，肿瘤恶性程度越高，预后越差[12]，也有学者[13，14]得出过不同的结论。本研究结果显示，MKK4蛋白在鼻咽癌组织中阳性表达率明显低于癌旁组织。我们前期结果研究表明肿瘤分期越晚，MKK4表达越高，与鼻咽癌恶性程度呈负相关[15]。细胞受到外界环境或细胞内信号的刺激，可激活JNK和(或)p38通路，导致肿瘤细胞内微环境变化，进一步引起MKK4蛋白表达异常。由此推测MKK4蛋白表达下调可能是鼻咽癌发生的启动因素之一。

SNP是指由于单个碱基的转换、缺失和插入，导致在不同个体间DNA序列中单个碱基的差异[16]。近来研究发现MKK4基因启动子区-1304 T/G多态性与多种恶性肿瘤易感性相关，MKK4基因启动子区-1304 G突变能够降低各种恶性肿瘤的患病风险。Wei等[19]发现MKK4基因启动子区-1304 T→G突变与大肠癌的发病有一定相关性，G突变能减少大肠癌的发生，但冯飞跃等[20]在食管癌中的研究认为MKK4启动子区-1304 T>G突变与食管癌无关。本研究发现MKK4基因启动子区-1304 T/G多态性与鼻咽癌关系密切[18]，MKK4蛋白低表达者与高表达者MKK4基因启动子区-1304 T→G突变发生率差异有统计学意义。MKK4蛋白高表达患者携带-1304 GG和-1304 GT的发生率高于低表达患者，可能是通过上调MKK4蛋白表达而增强MKK4基因启动子的活性，同时随着MKK4蛋白表达的增高，-1304 TG和-1304 GG检出率逐渐增高，-1304 T→G突变能上调MKK4蛋白表达。国内刘斌等[21]发现EB病毒阳性的MKK4基因患者携带TG基因型者患鼻咽癌的危险性下降了22%，而GG基因型发病风险下降了36%，且随着保护性等位基因(G)个数的增加，鼻咽癌发病的风险呈逐渐下降趋势，与本研究结果基本一致。

总之，鼻咽癌组织中MKK4蛋白阳性表达率降低，MKK4蛋白低表达可能与鼻咽癌发病有关；MKK4基因启动子区-1304 T→G突变能上调MKK4蛋白表达。随着MKK4与鼻咽癌关系研究的不断深入，其分子机制将被逐步了解，这将为鼻咽癌的诊断和治疗提供更多帮助。

[1] Chen L, Hu CS, Chen XZ, et al. Concurrent chemoradiotherrapy plus adjuvant chemotherapy versus cencurrent chemotherapy alone in patients with locoregionally advanced nasopharyngeal carcinoma: A plus 3 multicentre randomised controlled trial[J]. Lancet Oncol, 2012,13(2):163-171.

[2] 鲁明骞,孔庆志.丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路在恶性肿瘤中的研究现状[J].实用癌症杂志,2013,28(3):320-321.

[3] 鲁明骞,许新华.MKK4与恶性肿瘤相关性的研究进展[J].山东医药,2011,51(19):110-111.

[4] 黄闯,陈鸿雁.MKK4与肿瘤关系的研究进展[J].中华肿瘤防治杂志,2009,16(5):390-393.

[5] Taylor JL, Szmulewitz RZ, Lotan T, et al. New paradigms for the function of JNKK1/MKK4 in controlling growth of disseminated cancer cells[J]. Cancer Lett, 2008,272(1):12-22.

[6] Tang KF, Tan SY, Chan SH, et al. A distinct expression of CC chemokines by macrophages in nasopharyngeal carcinoma: implication for the intense tumor infiltration by T lymphocytes and macrophages[J]. Hum Pathol, 2001,32(1):42-49.

[7] Whitmarsh AJ, Davis RJ. Role of mitogen-activated protein kinase kinase 4 incancer[J]. Oncogene, 2007,26(22):3172-3184.

[8] Wuestefeld T, Pesic M, Rudalska R, et al. A Direct in vivo RNAi screen identifies MKK4 as a key regulator of liver regeneration[J]. Cell, 2013,153(2):389-401.

[9] An J, Liu H, Magyar CE, et al. Hyperactivated JNK is a therapeutic target in pVHL-deficient renal cell carcinoma[J]. Cancer Res, 2013,73(4):1374-1385.

[10] Khamis ZI, Iczkowski KA, Sang QX. Metastasis suppressors in human benign prostate, intraepithelial neoplasia, and invasive cancer: their prospects as therapeutic agents[J]. Med Res Rev, 2012,32(5):1026-1077.

[11] Divya SP, Wang X, Pratheeshkumar P, et al. Blackberry extract inhibits UVB-induced oxidative damage and inflammation through MAP kinases and NF-κB signaling pathways in SKH-1 mice skin[J]. Son YOToxicol Appl Pharmacol, 2015,284(1):92-99.

[12] Coleman MP, Quaresma M, Berrino F, et al. Cancer survival in five continents: a worldwide population-based study (CONCORD)[J]. Lancet Oncol, 2008,9(8):730-756.

[13] Bozdogan O, Yulug IG, Vargel I, et al. Differential expression patterns of metastasis suppressor proteins in basal cell carcinoma[J]. Int J Dermatol, 2015,54(8):905-915.

[14] Wu CW, Li AF, Chi CW, et al. Human gastric cancer kinase profile and prognostic significance ofMKK4 kinase[J]. Am J Pathol, 2000,56(6):2007-2015．

[15] 鲁明骞,孔庆志,许新华,等.MKK4蛋白在鼻咽癌组织中的表达与临床意义[J].中国免疫学杂志, 2015,31(9):1235-1238.

[16] Taylor JL, Szmulewitz RZ, Lotan T, et al. New paradigms for the function of NKK1/ MKK4 in controlling growth of disseminated cancer cells[J]. Cancer Lett, 2008,272(1):12-22.

[17] 鲁明骞,孔庆志,许新华,等.MKK4基因启动子区-1044 A>T多态与鼻咽癌易感性的研究[J].重庆医学,2015,44(34):4793-4795.

[18] 鲁明骞,孔庆志,许新华,等.MKK4基因启动子区-1304 T/G多态性与散发性鼻咽癌易感性的关系[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2016,30(4):287-290.

[19] Wei YS, Kuang XH, Zhu YH, et al. Interleukin-10 gene promoter polymorphisms and the risk of nasopharyngeal carcinoma[J]. Tissue Antigens, 2007,70(1):12-17.

[20]冯飞跃,郑健,姜岚,等.MKK4基因启动子区-1304 T>G多态与食管癌易感性研究[J].中华肿瘤防治杂志,2012,19(2):88-91.

[21]刘斌,黄斌芳,杨磊,等.EB病毒-MKK4基因遗传变异的交互作用与鼻咽癌危险性研究[J].实用医学杂志,2012,28(2):175-177.

湖北省自然基金面上项目(2014CFB675)；湖北省教育厅重点项目(D20141205)；湖北省卫计委科研基金项目(WJ2015MB176)；宜昌市科技研究与开发项目(A12301-03)。

孔庆志(E-mail： whzlkqz@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.020

R739.6

B

1002-266X(2016)31-0063-03

2016-02-18)