浅析影响血凝和血凝抑制试验的因素

赵 莉

（辽宁省鞍山市台安县动物疫病预防控制中心，辽宁鞍山 114100）

浅析影响血凝和血凝抑制试验的因素

赵 莉

（辽宁省鞍山市台安县动物疫病预防控制中心，辽宁鞍山 114100）

血凝和血凝抑制试验是兽医实验室检测禽流感、新城疫免疫抗体的最常用方法之一。它也是检查防疫质量的重要依据。但在实验操作过程中，经常受到各种因素的影响，造成实验结果误差。

血凝；血凝抑制试验；诊断

1 被检样品

1.1 样品的采集

随机采集的样品要能够代表整个鸡群。一般情况下，同一批次的抽检比例为1～5%。日龄不同，免疫时间不同的样品，应分开编号，不能混在一起编号。采血部位一般以静脉为主。采血时，将注射器活塞向后拉一小段，留出部分空间。对采血部位先进行酒精棉消毒，干燥后进行采血取样。取样时动作要缓慢平稳，避免刺破静脉。取样后，将注射器稍倾斜，便于血清的析出。

1.2 被检血清

血样在运输过程中要尽量避免振荡和摇晃，以免溶血。一般情况下气温在25℃以上时全血易凝固，若气温过低可在培养箱中孵育，待血清析出后3000r/min离心2～5min，即可得到淡黄色透明血清样品。血清样品要及时进行检测，如不能及时检测，需在5d内检测的样品可放在4℃保存，超过一周要放在-20℃环境下冷冻。被检血清应避免反复冻融，否则抗体会降低。

2 反应板的选择

HA与HI试验结果的准确与否与V型反应板的质量密切相关。建议反应板应选择一次性使用96孔V型反应板，板面及凹孔干净，板面应水平，不能弯曲、倾斜。

3 抗原效价的测定及试剂配制

3.1 抗原的保存

抗原应按照说明保存。进行抗原效价测定时应做回滴实验，避免出现误差。测定好效价的抗原如一次不能用完应分装到灭菌离心管内，并标明日期和效价，每管的量最好是一次使用的量，避免反复冻融。

3.2 稀释液

HA、HI试验的缓冲体系是0.01M pH7.2PBS，并保持整个试验各步骤缓冲体系的一致。缓冲液最好先用现配，高压灭菌后使用，冷藏放置一般不超过一个月，PBS放置时间过长或出现絮状沉淀时不宜再使用。稀释液的pH值应控制在7.2。pH值在5.8以下红细胞易自凝，pH值在7.8以上凝集图像易消失，而pH值在7.2时红细胞沉淀最充分，图形最清晰，HI效价也最高。

3.3 红细胞悬液

配制1%红细胞悬液，最好选择采取2～3只SPF鸡，或未进行任何免疫的成年公鸡血。配制过程中须吸取试管底部的红细胞进行稀释配制，若吸取上层红细胞则可能导致红细胞悬液浓度偏低。配好的红细胞原液4℃保存备用，试验中使用的1%红细胞悬液要现用现配，另外不可使用破裂溶血的红细胞进行试验。

4 加样

病毒悬液和红细胞悬液在使用前一定要摇匀，以保证每孔中加入的浓度和数量准确一致，避免加入的浓度和数量高低不一，造成误差。摇晃红细胞悬液时力度不宜过大，防止红细胞破裂，造成溶血。

加液体时，一定要保持移液器吸头与反应板之间的距离，避免吸头与反应板中的液体接触造成污染。

稀释血清时，动作要缓慢，避免产生气泡，造成结果不准确。

5 温度和时间

温度通常应在20～25℃，室温不适宜的情况下应置于恒温箱内。温度高于37℃时，红细胞很快沉降下来，导致试验不成立；低于20℃时反应速度减慢，在规定时间内观察，对照结果不成立。加入红细胞放置时间应按照规定时间及时观察，超过10min以上，红细胞发生裂解。

［1］ 王孟华.浅析影响血凝和血凝抑制试验的因素［J］.福建畜牧兽医，2004，26（6）：51-52.