严重发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）总抗体检测试剂盒（ELISA）的研制

马玉英

（宁夏贺兰县农牧渔业局动物卫生监督所，宁夏银川 750001）

严重发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）总抗体检测试剂盒（ELISA）的研制

马玉英

（宁夏贺兰县农牧渔业局动物卫生监督所，宁夏银川 750001）

为建立检测严重发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）血清总抗体的双抗原夹心ELISA方法并进行初步试用。通过原核表达得到SFTSV-NP重组蛋白，以该蛋白作为ELISA的包被和酶标记抗原，确定抗原的最佳包被浓度和血清稀释度，优化各项试验条件，在此基础上研制试剂盒，并对试剂盒的重复性、特异性等方面进行研究。结果发现抗原最适包被浓度为4.0μg/ml，血清的最佳稀释浓度为1∶40，重复性试验表明批内和批间的变异性都低于10%。该试剂盒敏感性高、特异性强、重复性良好，可应用于SFTSV的研究和临床检测。

严重发热伴血小板减少综合征病毒；抗体；酶联免疫吸附试验

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、血清

SFTSV毒株、阳血清均由江苏疾病预防控制中心病原微生物研究所保存。

1.1.2 引物、原核表达载体

引物、原核表达载体pET28a-NP均由江苏疾病预防控制中心病原微生物研究所构建。

1.1.3 试剂及主要仪器

病毒TRNA提取试剂TRIzol、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、等购自大连宝生物工程有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）、弗氏完全、不完全佐剂购自美国Sigma公司；PCR仪：德国Biometra公司产品；恒温仪、离心机：德国Eppendorf公司产品；DEM一Ⅱ自动酶标洗板机：北京拓普生产；MODEL680型酶标仪；96孔可拆式ELISA酶标板：丹麦NUNC公司生产。

1.2 方法

1.2.1 制备重组抗原

根据Trizol试剂说明书从血清中提取总RNA，通过RT-PCR技术扩增出SFTSV-NP基因，分别用限制性内切酶BamHI、EcoRI酶切上述扩增片段与质粒pMD18-T，回收目的基因和载体片段，进行连接反应。将连接产物转化感受态宿主菌E.coliDE3，挑取经酶切鉴定的单个白色菌落，37℃培养至OD600nm为0.4～0.6时，加ITPG37℃诱导6h，收集菌体，纯化目的蛋白，具体操作步骤参考文献。

1.2.2 酶标记抗原

对表达纯化的NP重组蛋白采用过碘酸钠法标记辣根过氧化物（HRP），经Supperdex200分子筛分离纯化。

1.2.3 ELISA各项试验条件的优化

（1）酶标抗原的最佳使用浓度

将酶标抗原进行不同浓度的稀释，各取1滴加入系统采用的1ml底物液中，迅速混匀后观察颜色变化，在1～1.5min内出现明显颜色变化的二抗浓度，也就是最佳的酶标抗原使用浓度。

（2）在已确定的各种条件下，选择适合的封闭液和稀释液

分别用5～10%脱脂奶粉、5～10%马血清、1%白明胶、1% BSA作封闭液；用1～5%脱脂乳、3～5%马血清、0.1%白明胶、0.1%BSA作稀释液，测450nm的OD值，选本底低、P/N值大、OD值最高者为最适。

（3）各个步骤作用时间的选择（选择本地值低、P/N比值最高者为最适作用时间）

包被条件：其他条件不变，选择4℃过夜、37℃作用1h后4℃过夜、37℃作用2h，这3个梯度；

封闭时间：设0.5h、1h、2h、4h，共4个梯度；

血清样品反应时间：设10min、20min、30min、40min，共4个梯度；

酶标抗原作用时间：设30min、1h、2h，共3个梯度；

显色时间：设显色时间分别为5min、8min、10min、12min、14min，共5个梯度。

（4）临界值的确定

随机挑取SFTSV抗体阳性血清20份，抗体阴性血清80份，以优化的抗原包被量和血清工作浓度对血清进行ELISA检测，测定450nm的OD值，计算阴性血清的平均OD值（）和标准偏差（SD），求得阴阳性判定界限±3SD。

2 结果

2.1 重组抗原制备

原核表达质粒pET28a-NP转化E.coliBL21（DE3）后，经IPTG诱导获得表达蛋白与预期大小相符。表达产物经试剂盒纯化后纯化获得了较高纯度的目的蛋白。

2.2 ELISA各项试验条件优化结果

从方阵滴定法检测结果表1可以看到，随着包被抗原浓度的减少和血清稀释倍数的增加，血清的OD值不断降低，当抗原包被浓度在4μg/ml，血清稀释倍数为1：40时，阳性血清的OD值在1.0左右，且阴性血清的OD值低，阳性阴性血清比值（P/N）高。一般情况下，ELISA检测仪在检测OD值为1.0左右时误差最小，反应最灵敏，以此为根据我们选择4μg/ml的抗原包被量为最适包被浓度，而被检血清的最佳稀释为1：40。

2.3 ELISA判定标准的确定

实验测得阴性血清OD450nm均值范围为0.12±0.03，在此基础上确定该ELISA试剂盒的判定标准为S/N＞2.1，且阳性血清A450nm＞0.25时则待检血清SFTSV总抗体为阳性。

2.4 特异性试验

对其有出血热症的阳性血清和20份阴性血清进行检测，结果均为阴性，没有出现交叉反应。

2.5 敏感性试验

通过检测倍比稀释的阳性血清，结果显示当血清稀释浓度达到1：640时，按以上判定标准判定仍为阳性，说明该试剂盒的灵敏度为1：640.

3 结语

本试验使用重组蛋白NP作为包被抗原和酶标记抗原，建立了双抗原夹心ELISA法，并对其反应条件进行优化，在此基础上研制出ELISA试剂盒。通过对试剂盒的检测表明其特异性良好，未于布尼亚其他病毒发生交叉反应，并且ELISA方法的成功建立克服了其他检测法存在的缺点，该试剂盒的检出率高，费用少，对仪器及检验员的要求不高，为试剂盒的推广应用奠定了基础。

［1］ 刘雅婷，张文超，李正跃，等.布尼亚病毒科全基因组序列比对分析［J］.云南农业大学学报，2008，23（3）：315-320.

［2］ 陶文元，陶欣.新型布尼亚病毒感染致发热伴血小板减少综合征8例报告［J］.江苏大学学报（医学版），2011，21（1）：91-92.