浅谈奶牛结核病诊断技术及应用进展

李玉文 董在坤 邢春伟

（唐山市汉沽管理区动物卫生监督所，河北唐山 301501）

浅谈奶牛结核病诊断技术及应用进展

李玉文 董在坤 邢春伟

（唐山市汉沽管理区动物卫生监督所，河北唐山 301501）

奶牛结核病是由结核分枝杆菌引起的人畜共患传染病，其传播流行影响畜牧业的持续发展和人类的健康。结核病的早期预防与阳性牛淘汰措施仍是控制疫情的主要手段。近年来，随着细菌学检测和血清检测技术的不断发展，结核病诊断方法有了很大进展，本文就结核病的诊断技术进行综述。

奶牛结核病；诊断；检测

近年来，由于奶产品消费逐步加大，随着全国大市场、大流通的进一步形成，奶牛交易频繁，奶牛结核病的发生呈逐步上升趋势，严重影响着动物源性公共卫生安全，极大危险着人民群众的身体健康，被世界动物卫生组织（OIE）列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。奶牛结核病的诊断大体上可归为两类：一是临床症状诊断；二是实验室诊断，包括细菌学检测，如涂片镜检、细菌培养、动物实验等；免疫学检测；分子生物学诊断技术等。传统的细菌学方法由于繁琐费时，检出率低，灵敏度差，已不能满足当前疫病诊断的需要。目前世界各国都在致力于研究开发奶牛结核病诊断的快速方法，并已经建立了一些快速、准确、可靠的新型检测技术，有些技术已经在生产实践中得到了广泛的应用。

1 细菌学检测

细菌学检测的方法有涂片镜检、细菌培养等。临床上样品中的牛分枝杆菌可通过涂片抗酸染色、镜检并通过细菌培养做出确认。涂片抗酸染色法所需材料设备简单，操作方法简便，是较为普遍应用的方法。由于此方法检出的细菌只能说明有抗酸杆菌存在，而且也不能准确的鉴定出结核分枝杆菌和非典型分枝杆菌，因此，其缺乏特异性。细菌培养需在37℃培养3～8周才可生长。菌落形态粗糙，中心隆起，周围大而边缘不规则，菌落颜色微白。细菌培养法到目前为止仍被认为是确诊结核的黄金标准。但牛结核分枝杆菌生长缓慢，有10～20%的病例结核菌培养失败。同时由于各种条件的影响，阳性率较难提高。

2 血清学检测

2.1 牛型结核菌素皮内变态反应（PPD）

PPD是目前公认最有效的方法，也是被世界动物卫生组织（OIE）确定的法定的检测方法，也是被世界各国接受和采用的方法。它主要是用提纯的PPD进行牛皮内接种，于72～120h后观察有无热、痛、肿胀等反应，对可疑的奶牛需60d后再次复检。该方法检出率和准确率都比较高。PPD作为皮肤实验最大的缺点就是容易出现假阳性和假阴性反应。当感染副结核分枝杆菌等环境分枝杆菌时则可能呈现假阳性反应，即PPD中大多数蛋白质与其他分枝杆菌和一些无关细菌的相同。对因感染其他分枝杆菌而致敏的动物没有特异性，不能判断病情，而且BCG疫苗中含有与PPD相同的抗原成分，因而PPD皮内变态试验不能鉴别是免疫动物还是感染动物。在一些国家，使用比较结核菌素试验（即比较皮内试验），在颈部一侧的不同部位，同时注射牛型PPD和禽型PPD以判断动物对两种PPD的不同反应，能够提示被检奶牛是被牛型分枝杆菌感染还是非特异的DTH反应。所以以PPD作为诊断工具的TST反应很难将结核菌显性感染和隐形感染以及BCG免疫的个体反应分开来。

2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）

此类方法是利用抗原抗体反应检测针对牛结核分枝杆菌抗原的循环抗体。目前用于检测的抗原有PPD、ESAT-6、CFP10、MPB59、MPB64、MPB70、MPB80、MPB83、Ag85、LAM（脂阿拉伯甘露聚糖）、LPS（脂多糖）等。ELISA中也可以利用免疫过氧化物酶，这种方法与传统的ELISA方法相比检测速度更快、成本更低、操作更简便。

2.3 r-干扰素试验

将试验牛血样的淋巴细胞加入特异性PPD一起孵育16-24h，由于致敏的淋巴细胞能够释放出r-干扰素，因此可用INF-r-ELISA进行定量测定。通过对结核杆菌和非结核分枝杆菌分子生物学的研究表明ESAT-6蛋白仅存在于结核杆菌复合体及少数致病性结核分枝杆菌中，90%以上的分枝杆菌不具有ESAT-6蛋白，因而将ESAT-6蛋白作为刺激抗原来检测释放到血中的INF-r水平是诊断牛结核病的较好方法。免疫学试验证明在ESAT-6蛋白上存在着T细胞和B细胞抗原表位，能够诱导强的细胞免疫和体液免疫应答，这极大地推动了以ESAT-6作为诊断试剂的研究价值。r-干扰素试验优于结核菌素试验的一个特点就是，即使动物体内抗原很少也能被检出，且可重复检查。由于接种了BCG使PPD试验很难对结核分枝杆菌的感染作出诊断，因此，迫切需要建立一个新的细胞免疫应答的检测方法，而全血INF-r检测方法很有可能成为替代传统的结核菌素皮内试验的结核病临床辅助诊断方法。

2.4 淋巴细胞增生实验

致敏的外周血淋巴细胞（PBL）在特异性抗原（如PPD、MPB70、MPB64等）刺激下，可使抗原特异性T淋巴细胞亚群发生增生反应。通过测定外周血循环中的增生淋巴细胞的比例可了解淋巴细胞增生的程度，间接反映淋巴细胞被特异性抗原致敏的情况，从而分析动物抗体对于牛分枝杆菌的细胞免疫状态。淋巴细胞增生实验主要是测定全血样品对结核菌素PPD抗原的细胞反应，因其费用较高，难于大面积使用。总的来讲，血清学试验的低敏感性归因于分枝杆菌感染引起的抗体免疫反应是细胞免疫占主导而非体液免疫。因此，血清学试验最好是作为细胞学试验的补充而不是替代。

3 分子生物学技术

3.1 PCR技术

聚合酶链式反应（PCR）对人结核和牛结核的诊断有很高的应用价值。应用PCR可检测出250fg分枝杆菌纯化DNA菌细胞的敏感度为50个菌，且整个检测过程仅需2d，蔡宏等用基因探针原位杂交技术检测用福尔马林固定、石蜡包埋组织中的牛分枝杆菌，在几天内就可获知分析结果。该法省去了为从组织中提取结核菌而进行的组织研磨处理结核杆菌DNA提取等繁琐步骤，敏感度为104～105个细菌/ml。

3.2 RFLP技术和Spoligotyping技术

RFLP技术和Spoligotyping技术主要用于结核病流行病学，对结核菌型的鉴定有重要意义。该方法只需少量的DNA直接利用细菌裂解产物进行鉴定，不需要对细菌进行培养来提取DNA。

4 奶牛结核病快速诊断技术

由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研究开发2种能够特异性鉴别奶牛结核病原的方法，能够检测到50pg的牛分枝杆菌的DNA，只需3h即可获得鉴定结果。1）PCR检测方法选择结核分枝杆菌复合体中的特有基因esat-6基因为PCR扩增的目的基因，通过特异性和敏感性分析，建立以esat-6为目的基因的PCR检测方法，该方法具有快速、敏感和特异的特点，其敏感性和特异性到达了国外同类产品的检测水平；2）ELISA检测方法将多种特异性较高的抗原以串连融合的形式在大肠杆菌中，实现了高效表达，生产出牛结核病诊断抗原，通过对临床样品的检测结果显示，本研究建立的ELISA方法能够快速检测出结核阳性病牛，具有很好的特异性和开发前景。

5 结语

牛结核病的控制和永久根除需要政府部门和广大兽医工作者的共同努力下才能实现。提高诊断技术和研究更有效的疫苗是实现结核病根除的有效方法。近年来随着分子生物学技术的发展，已经有亚单位疫苗、活载体疫苗和新型DNA疫苗的问世，为牛结核病的检测和预防提供了一条崭新的途径。

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［2］ 蒋柏茂，李文平，刘从松，等.奶牛结核病实验室诊断技术研究进展［J］.中国奶牛，2009，（4）：38-40.

［3］ 张玉海，贺玲玲，王俊江.浅谈奶牛结核病的病征与诊断及其防控策略［J］.养殖与饲料，2009，（1）：22-23.