Wnt通路关键分子Wnt3a表达对肝癌诊断与鉴别诊断价值*

王晗，姚敏，杨君伶，潘刘翃，闫辉，韩静，岳明，姚登福

（1南通大学附属医院临床医学研究中心，江苏南通226001；2复旦大学附属中山医院；3中国人民解放军150中心医院；4南京医科大学第一附属医院）

Wnt通路关键分子Wnt3a表达对肝癌诊断与鉴别诊断价值*

王晗1,2，姚敏1，杨君伶1，潘刘翃1，闫辉3，韩静3，岳明4，姚登福1

（1南通大学附属医院临床医学研究中心，江苏南通226001；2复旦大学附属中山医院；3中国人民解放军150中心医院；4南京医科大学第一附属医院）

目的：分析Wnt通路关键信号分子Wnt3a表达对HCC的诊断价值。方法：收集80例肝癌、53例肝硬化及慢乙肝患者和40例健康对照血清，用ELISA检测Wnt3a水平,与AFP比较评估Wnt3a诊断价值;以免疫组化法分析80例肝癌及癌周组织Wnt3a表达。结果：肝癌患者血Wnt3a水平显著高于各良性肝病组(P＜0.001),与肝硬化、HBV感染、TNM分期显著相关(P＜0.05)；如以800 ng/L为正常上限,诊断肝癌敏感度、特异度、准确度、阳性和阴性预测值分别为92.5%、94.3%、93.2%、96.1%和89.3%,与AFP联检敏感度达96.3%,ROC下面积为0.994高于AFP的0.710(P＜0.001)。癌组织Wnt3a定位于胞浆和细胞膜上,阳性率96.2%显著高于癌周组46.3%(P＜0.001);癌组织Wnt3a高表达(3～6分)占71.3%,癌旁组仅13.8%。Wnt3a高表达与分化等级、肝硬化、HBV感染、TNM分期显著相关(P＜0.01)。结论：Wnt通路关键信号分子Wnt3a表达是良、恶性肝病诊断与鉴别的特异标志物。

肝细胞性肝癌；Wnt3a；诊断；信号通路

肝细胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的恶性肿瘤之一。HCC患者治疗以手术为主，非手术为辅助，虽有多种激酶抑制剂如索拉非尼能延长HCC患者生存期，但其发现较晚，预后不佳[1-2]。HCC发生发展是复杂的多阶段过程，涉及基因突变、染色体畸变、表观遗传学改变以及多种相关信号通路的调节异常[3]。Wnt通路激活与肝癌发生和进展相关，经典通路关键信号分子Wnt3a位于染色体17q21，胚胎发育早期被激活，在细胞更新和分化过程中起重要作用。近来，发现Wnt3a经硫酸酯酶-2和磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（glypican-3，GPC-3）激活Wnt经典通路[4-5]，促进肝癌细胞增殖和裸鼠皮下移植瘤生长，可能是HCC细胞重要调节分子，然而在肝病进展过程中Wnt3a表达规律与临床价值尚未见报道。为此，本文通过检测HCC组织和血Wnt3a表达，以评估Wnt3a对良、恶肝病的诊断和鉴别诊断价值。

1 材料与方法

1.1 外周血标本收集

随机选取南通大学附属医院2013年12月至2014年12月收治的80例原发性肝细胞性肝癌患者，53例慢性乙型肝炎患者，53例肝硬化患者。另随机选取40例健康人作为正常对照组。患者的纳入及排除标准包括：①经病理证实为原发性肝细胞性肝癌；②有完整的临床病理资料；③未经手术，放化疗、内分泌及生物治疗。患者的相关临床资料收集自其病例记录，另选取的对照组标本来源和时间同肝癌组。以上226例血液标本收集后经3 000 r/min离心5～10 min，分离血清，-80℃低温冰箱冻存，供检测用。

1.2 肝癌组织标本

80例肝细胞性肝癌组织标本取材自南通大学附属医院2006～2008年肝癌手术切除标本，所选取的标本均符合以下标准：①经病理证实为原发性肝细胞性肝癌；②有完整的临床病理资料及随访数据；③手术之前均未接受过任何治疗。根据Edmondson分级系统进行组织分化等级评定，将肝癌病例分为高分化（Ⅰ），中分化（Ⅱ+Ⅲ）和低分化（Ⅳ）三组。根据临床影像学和术中探查结果综合判断门静脉癌栓的有无，两者皆提示存在门静脉癌栓则视为有门静脉癌栓。另选取80例癌旁组织标本作为正常对照。TNM分期结果根据国际抗癌联盟第六版TNM分期标准分为Ⅰ～Ⅳ期。所有病例均有完整随访资料，符合全国肝癌防治协作组制定的标准核实诊断[6]，随访从手术日起至死亡日或最后随访日期为止，随访日期截止至2013年10月。

1.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血Wnt3a浓度

Wnt3a ELISA试剂盒购自武汉优尔生科技有限公司；按Elisa试剂盒操作说明进行检测。操作步骤如下：加样：标准孔，待测孔和空白孔每孔各100 μL；37℃温育2 h；甩干，加检测液A每孔100 μL；37℃温育1 h；甩干，每孔用350 μL洗涤液洗涤3遍；每孔加检测液B100 μL；37℃温育30 min；甩干，每孔用350 μL洗涤液洗涤5遍；每孔加显色液90 μL；37℃温育25 min；每孔加终止液50 μL；用酶标仪在450 nm波长依次测量各孔的吸光度A值，并绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品标本中蛋白质浓度。

1.4 组织芯片及免疫组织化学染色

所有标本组织用10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋，常规石蜡切片，厚度4 μm，备用。常规脱蜡，水化，双氧水阻断内源性过氧化物酶，高压加热法修复抗原，用正常动物血清封闭非特异性结合。滴加鼠抗人Wnt3a抗体（ab81614;Abcam,UK），1∶50稀释，室温静置1 h，PBST漂洗5 min×3次，滴加羊抗鼠IgG二抗（A21010;Abcam,UK），1∶5 000稀释，室温静置30 min，PBST漂洗5 min×3次。DAB显色5 min，蒸馏水冲洗5 min。苏木素复染，盐酸乙醇分色，蒸馏水冲洗5 min。依此用75%、85%、95%、100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。芯片通过日本Olympus公司BX50光学显微镜进行观察及摄片。用0.01 mol/L PBS(pH=7.5)替代第一抗体、第二抗体作为阴性对照。

1.5 免疫组化分级标准

根据染色结果分为四级，深棕色且可见粗大有色颗粒者为+++，记3分，棕黄色且可见细小有色颗粒者为++，记2分，浅黄色未见明显有色颗粒者为+，记1分，不着色者为（-），记0分[7]。记录阳性染色细胞占所在切片中癌细胞的百分数，同样分四级：0%记0分，0%～33%记1分，33%～66%记2分，67%～100%记3分。两者之和为总得分，0～2为低表达，3～6为高表达。

1.6 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理，定性资料采用χ2分析，等级资料采用曼惠特尼-U检验。定量数据以均数±标准差±s)表示，两个样本均数的比较采用t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。Graphpad Prism 5.0和Medcalc软件分别绘制散点图和ROC曲线。

2 结果

2.1 肝癌组织Wnt3a表达与胞内分布特征

肝癌及癌周组织中Wnt3a表达及免疫组化分析见图1。染色根据程度分为棕黄色或棕褐色，主要定位于细胞浆中和细胞膜上。肝癌组织Wnt3a表达阳性率为96.3%（77/80，图1A和B）显著高于自身对照的癌周组织46.3%(37/80，图1C和D）χ2=48.818，P＜0.001。Wnt3a在肝癌组织和癌周组织的阳性表达率及其程度分级见表1。两组染色评分差异有统计学意义（Z=8.144，P＜0.001）。HCC组织中Wnt3a阳性高表达（3～6分）为71.3%（57/80），而癌旁组织仅为13.8%。

图1 肝癌组织和癌周组织Wnt3a表达的免疫组化分析

表1 肝癌和癌旁组织Wnt3a表达率及频度的比较

2.2 肝癌组织Wnt3a表达与HCC临床分期关系

Wnt3a表达和HCC临床分期之间的关系见图2。根据IUAC临床分期标准，80例癌组织中I期9例（11.3%，38/80），II期27例（33.8%，27/80），III期38例（47.5%，38/80），IV期6例（7.5%，6/80）。在各临床分期中Wnt3a高表达和低表达率分别是I期22.2%（2/9）和77.8%(7/9)，II期51.9%（14/27）和48.1%（13/27），III期94.7%（36/38）和5.3%（2/38），IV期83.3%（5/6）和16.7%（1/6）。这表明临床分期越晚，Wnt3a阳性表达率越高。

图2 Wnt3a表达与临床分期的关系

2.3 肝癌组织Wnt3a表达的临床病理学特征

根据Wnt3a在HCC中表达的平均评分为3分，将其分为高表达组（3～6分）和低表达组（0～2分）。肝癌组织Wnt3a高表达（n=57）和临床病理学特征之间的关系见表2。统计结果显示，Wnt3a高表达与分化等级（P=0.001），肝硬化（P=0.004），HBV感染（P＜0.001），TNM分期(P＜0.001)显著相关。但与患者年龄、性别、AFP、肿瘤大小，门静脉癌栓间差异无统计学意义。

表2 肝癌Wnt3a的表达和临床病理因素之间的关系

2.4 血Wnt3a诊断肝癌及其评价

HCC、肝硬化、慢性肝病及正常对照组血Wnt3a表达见表3。HCC组血Wnt3a平均水平显著高于其他慢性肝病组（P＜0.001）,分别是肝硬化4.0倍，慢性肝炎9.2倍，正常对照26.7倍。如以Wnt3a＞800 ng/L，AFP＞50 ng/mL为界，诊断HCC阳性率为92.5%和61.3%，肝硬化5.7%和30.2%，慢性肝炎0和9.4%，正常对照组未见阳性，良性肝病中仅3例肝硬化患者阳性；如Wnt3a以＞1 000 ng/L，良性肝病组未见阳性；将AFP调至100 ng/mL，良性肝病组仍有阳性病例占15.1%。Wnt3a和AFP对HCC诊断的ROC曲线(图3)，Wnt3a为0.994，AFP为0.710（CI：0.625～0.786，P＜0.001）。如表4所示，Wnt3a的诊断敏感度、特异度、准确度、阳性和阴性预测值均在90%左右，明显高于AFP。两者联检敏感度会提至96.3%。

表3 慢性肝病患者循环血Wnt3a及AFP水平

图3 血清Wnt3a和AFP数值散点图及ROC曲线图

表4 肝癌患者血清Wnt3a和AFP诊断价值评估

3 讨论

Wnt家族是一类富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，已有19种家族成员。目前研究发现在人类多种肿瘤存在Wnt家族成员异常表达，可能参与激活Wnt信号通路[8]。体外研究发现Wnt家族成员Wnt3a在HCC细胞生长过程中是重要的分子，和SULF2和GPC-3结合后能诱导激活经典Wnt信号通路，移植瘤研究发现Wnt3a增加HCC细胞增殖能力[9]。然而目前没有研究报道Wnt3a表达和HCC诊断的关系。本文分析了慢性肝病患者循环血、肝癌以及癌旁组织Wnt3a的表达，探索Wnt3a作为HCC诊断标志物的应用价值。

本研究显示，HCC组织Wnt3a免疫组化染色呈棕色,分布于癌细胞的胞质和细胞膜，癌旁组织仅见少量阳性表达。统计结果表明，HCC组织Wnt3a阳性率显著高于癌旁组织，TNMⅣ期患者的癌组织Wnt3a染色呈强阳性，并且Wnt3a的表达与HCC发生和进展相关。尽管血AFP是肝癌最常用的标记物，但敏感性和特异性均不高，假阴性率或阳性率高。肝癌细胞表达Wnt3a并分泌入血，血Wnt3a阳性率(>800 ng/L)为92.5%，良性肝病仅3例肝硬化阳性。临床资料分析结果显示，Wnt3a表达与HBV、分化程度、TNM分期相关。比较ROC曲线下面积，Wnt3a明显优于AFP，联合Wnt3a及AFP提升诊断敏感度至96.3%，表明血Wnt3a可作为诊断HCC的特异标记，并有助于良、恶性肝病的鉴别诊断[10]。

肝癌和血清Wnt3a水平与临床病理特征之间的关系均表明高表达Wnt3a与分化等级，HBV感染，肝硬化及TNM分级显著相关，提示Wnt3a参与HBV慢性感染进展过程；肝硬化，HBV感染和Wnt3a高表达是HCC患者不良预后的独立预测因素。HCC组织Wnt3a表达明显高于癌旁组织，外周血Wnt3a过表达，联合检测Wnt3a与AFP有助于HCC诊断；癌组织Wnt3a高表达与HCC患者生存期密切相关。尽管Wnt3a在HCC中过表达分子机制尚不完全清楚，但其作为具有潜在价值的HCC诊断及鉴别分子标志，具有良好应用价值；对其深入研究，有望成为早期诊断和预后指标或有效的治疗靶点[11-12]。

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（2016-07-29收稿）

Diagnostic and differential values of key signal molecule Wnt3a expressed in the Wnt pathway for hepatocellular carcinoma

Wang Han1，2,Yao Min1,Yang Junling1,Pan Liuhong1,Yan Hui3,Han Jing3,Yue Ming4，Yao Dengfu11Research Center of Clinical Medicine,the Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong,Jiangsu Province,226001；2Zhongshan Hospital of Fudan University;3150th Central Hospital of PLA;41st Hospital of Nanjing Medical University,China

Objective:To explore the diagnostic values of the key signal molecule Wnt3a expression for hepatocellular carcinoma(HCC).Methods:Circulating Wnt3a levels were determined in a total of 186 patients (80 HCC,53 liver cirrhosis and 53 chronic hepatitis)and 40 controls by ELISA,and were compared with levels of AFP to evaluate their diagnostic and differential diagnostic values for hepatocellular carcinoma.The expression of Wnt3a in 80 HCC and their surrounding tissues was analyzed by IHC for clinicopathological features.Results:The average levels of serum Wnt3a expression were significantly higher(P＜0.001)in the HCC group than those in any other groups of benign liver diseases.Wnt3a expression in HCC patients were closely related(P＜0.05)to liver cirrhosis,HBV infection,poor differentiation,and TNM staging.The sensitivity,specificity,accuracy,positive predictive value and negative predictive values of Wnt3a were 92.5,94.3,93.2,96.1 and 89.3%respectively when Wnt3a of 800 ng/L was used as the cutoff value for diagnosis of HCC.When Wnt3a and AFP were combined,the sensitivity rose to 96.3%,and the area under curve in Wnt3a(0.994)was higher than in AFP(0.710)with the ROC curve.The positive Wnt3a with brown staining particles were mainly distributed in cytosol and membrane ofhepatocytes.Higher Wnt3 expression was seen in 71.3%cancerous and 13.8%surrounding tissues,and associated with poor differentiation,cirrhosis,HBV,and high TNM stage(P＜0.01).Conclusion:As a key molecule in the Wnt signaling pathway,Wnt3a may be used as a specific marker for HCC diagnosis and differential diagnosis.

Hepatocellular carcinoma,Wnt3a；Diagnosis；Signaling pathway

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.05.009

*国家国际科技合作项目(2013DFA32150)；江苏省六大人才高峰项目(2014-YY-028)

王晗（1992-），男，硕士生。

姚登福，教授，博士生导师。E-mail：yaodf@ahnmc.com