氨茶碱与华法林在大鼠体内药动学与药效学的相互影响

何　勇　　周曙华　　王　烈　　杨双明　　黄金保　　吴　阳.安徽省池州市人民医院药剂科，安徽池州　47000；.安徽省池州市人民医院检验科，安徽池州　47000



氨茶碱与华法林在大鼠体内药动学与药效学的相互影响

何勇1周曙华1王烈2杨双明2黄金保2吴阳1
1.安徽省池州市人民医院药剂科，安徽池州247000；2.安徽省池州市人民医院检验科，安徽池州247000

[摘要]目的考察氨茶碱与华法林在大鼠体内是否存在药动学和药效学的相互作用，为临床上联合用药提供实验依据。方法华法林对氨茶碱药动学影响实验中，将16只雄性SD大鼠随机分成华法林+氨茶碱合用组（合用组）和氨茶碱组（单用组），每组8只，于给药后不同时间点采集血样，用高效液相色谱法测定茶碱的血药浓度，采用PKBP药代动力学软件包计算药动学参数，并对参数进行统计分析。氨茶碱对华法林药效学影响实验，将60只雄性SD大鼠按体重随机分成3组，即未用药组、华法林+氨茶碱合用组（A组）和华法林组（B组），每组20只，在最后一次灌胃给药1 h后短尾取血，用全自动凝血分析仪测定血浆凝血酶原时间（PT）、国际标准化比率（INR），实验结果进行统计分析。结果合用组达峰时间（Tmax）较单用组明显提前，Vd/F差异有统计学意义（P＜0.05），而两组的其他参数峰浓度（Cmax）、消除半衰期（t1/2）、血药浓度时间曲线面积（AUC0～∞）、平均滞留时间（MRT）比较差异无统计学意义（P＞0.05）。A组和B组较未用药组PT、INR值比较差异有统计学意义（P＜0.05）；A组与B组PT、INR值比较差异无统计学意义（P＞0.05），但合用组大鼠的INR高值相对较多。结论氨茶碱或茶碱与华法林联合使用时，氨茶碱或茶碱血药浓度监测采血时间（峰浓度）可能需要提前，同时更应密切监测患者的INR值，以便及时发现有严重出血倾向的患者，调整华法林的用量或采取补救措施，确保华法林使用的安全有效。

[关键词]氨茶碱曰茶碱曰华法林曰药动学曰药效学曰药物相互作用

华法林是双香豆素衍生物，通过抑制维生素K及其环氧化物的相互转化而发挥抗凝作用。作为最老的口服抗凝药物，华法林仍然是需要长期抗凝治疗患者的最常用药物，包括静脉血栓栓塞性疾病（VTE）的一级和二级预防、心房颤动血栓栓塞的预防、可预防瓣膜病、人工瓣膜置换术和心腔内血栓形成等[1-5]。口服华法林钠的生物利用度＞90%，与蛋白大量结合，游离华法林为0.5%～3%。华法林钠被肝代谢清除，通过肝微粒酶CYP2C9（S-华法林）及CYP1A2、CYP3A4（R-华法林）代谢成无活性代谢物后随尿液排泄[6]。华法林与许多药物或食物同服时都会产生不良相互作用[7-8]，不仅影响华法林的抗凝作用，同时容易引发不良反应，所以临床上通过监测凝血酶原时间（PT）及国际标准化比率（international normalized ratio，INR）来评价华法林的抗凝强度[2]。氨茶碱临床常用于缓解支气管哮喘、喘息性支气管炎、阻塞性肺气肿等喘息症状。主要在肝脏中被细胞色素P450系统CYP1A2代谢，其血清浓度可以反映药理效应。氨茶碱在体内水解为茶碱和乙二胺，茶碱的毒性常出现在血清浓度为15～20μg/mL时，当血清浓度超过20μg/mL时常可出现心动过速、心律失常，严重的甚至引起呼吸、心跳停止致死。临床上使用氨茶碱一般推荐进行血液中药物浓度监测（therapeutic drugmonitoring，TDM）[9]。华法林和氨茶碱都属于治疗窗较窄的药物，但疗效显著，因此临床应用广泛，经常会出现患者同时服用这两种药的情况。特别是老年患者伴发疾病较多，更可能同时服用此两种药物，且更易受药物影响。目前国内外对此两种药物联用的基础研究信息匮乏，给临床合理用药造成困难。本研究采用动物试验研究，探讨两种药物联合使用的药动学和药效学的相互影响，为进一步的临床联合用药提供实验依据和指导。

1　仪器与材料

1.1仪器

LC-10ATVP高效液相色谱仪（日本岛津公司），SPD-10AVP型检测器（日本岛津公司）和TG288A电光分析天平（上海天平仪器厂，分度：0.1mg），TGL-16G高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），ACL TOP700全自动凝血分析仪（美国IL公司），WXH微型漩涡混合器（上海跃进医疗器械厂），电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械厂，温度波动：±0.5℃）。

1.2药品与试剂

茶碱标准品（批号：100121-199903），华法林标准品（批号：101163-201001，含量为92.3%），咖啡因（批号：171215-200305）皆为中国药品生物制品检定所提供；冰醋酸、乙酸乙酯为分析纯；乙腈、甲醇为HPLC级；水为重蒸馏水。氨茶碱注射液10mL、0.25 g（批号：120601，上海信谊金朱药业有限公司），华法林钠片2.5mg（批号：130101-C，上海信谊九福药业），注射用水500mL（批号：1304157-C，安徽双鹤药业有限公司）。

1.3动物

健康成年雄性SD大鼠76只，SPF级，7～8周龄，235～305 g，安徽医科大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（皖）2011-002。实验前12 h禁食不禁水。

2　方法与结果

2.1动物的分组尧给药及采血

2.1.1华法林对氨茶碱药动学影响组将氨茶碱注射液用生理盐水稀释，将华法林钠片（每片5mg）研碎，注射用水溶解，用前充分混匀。取16只雄性SD大鼠按体重随机分成两组，即华法林+氨茶碱合用组（合用组）和氨茶碱组（单用组），每组8只。参照文献[10-15]，合用组于每日早晨灌胃给予华法林钠0.2 mg/kg，每日1次，连续7 d，至华法林血药浓度达稳态，并在第7日灌胃给予华法林后灌胃给予氨茶碱20mg/kg；单用组给予同等剂量的注射用水，第7日同样灌胃给予氨茶碱20 mg/kg。两组大鼠分别在氨茶碱给药后0.08、0.25、0.50、1、2、4、8、12、24 h断尾取血1mL于1.5mL塑料离心管内，所有血样立即以16 000 r/min高速离心5min后，吸取血浆，冷冻备用。断尾处纱布压迫止血。2.1.2氨茶碱对华法林药效学影响组取60只雄性SD大鼠按体重随机分成3组，即未用药组、华法林+氨茶碱合用组（A组）和华法林组（B组），每组20只。参照文献[16]，未用药组给予同等剂量的注射用水；合用组于每日早晨依次灌胃给予氨茶碱20 mg/kg、华法林钠0.2mg/kg；单用组给予同等剂量的注射用水、华法林钠0.2 mg/kg，每日1次，连续7 d，至氨茶碱、华法林血药浓度达稳态，在第7日灌胃给予华法林后1 h，断尾取血1.5 mL。所采血样置于抗凝剂枸橼酸钠的试管中，血液和抗凝剂的体积比为9∶1，轻轻混匀，3700 r/min离心10min后，用全自动凝血分析仪测定血浆PT、INR值。

2.2茶碱血药浓度的测定

2.2.1色谱条件采用Shimpack Vp-ODS色谱柱（4.6mm× 150mm，5μm），以水-乙腈（87∶13，V/V，每100mL混合液加冰醋酸200μL、三乙胺170μL）为流动相，流速1.0mL/min，室温，检测波长273 nm。

2.2.2茶碱与内标对照品溶液的配制精密称取茶碱对照品适量，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得茶碱的质量浓度为254.0μg/mL，可依次逐级稀释，得系列标准溶液。精密称取咖啡因（内标）对照品适量，置于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得咖啡因的质量浓度为246.0μg/mL。对照品溶液于4℃冰箱中保存备用。

2.2.3血浆样品预处理取血浆100μL置于10mL离心管中，加入8μL内标液，涡旋混合30 s，再加入萃取剂乙酸乙酯1.5mL进行液液萃取，涡旋振荡3min，4000 r/min离心5min，吸取上清液，50～55℃水浴，氮气流下吹干，残渣用100μL流动相涡旋3min复溶，4000 r/min离心5min，取上清液20μL进样测定。

2.2.4系统专属性考察按“2.2.3”项下方法分别制得空白血浆、空白血浆中加入茶碱和内标溶液、大鼠灌胃给予氨茶碱（20mg/kg）后1 h血浆的高效液相色谱图，茶碱与内标咖啡因的保留时间分别为4.5min和7.2 min，二者峰形良好，理论塔板数4000左右，且血浆中其他成分不干扰茶碱的测定。见图1。

图1　系统专属性考察色谱图

2.2.5标准曲线的制备取空白血浆100μL 7份，分别加入茶碱对照品梯度浓度溶液10μL，制备相当于茶碱浓度为0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.7、25.4μg/mL的标准系列血样，按“2.2.3”项下方法分析，进样20μL，记录色谱图。以茶碱与内标的峰面积比值（X）为横坐标、茶碱血药浓度（Y）为纵坐标。以Y对血药浓度（X）作线性回归，得回归方程Y=17.616 X-0.6272，r= 0.9991，可见茶碱在0.4～25.4μg/mL范围内,其浓度与茶碱和内标的峰面积比值呈良好线性关系，茶碱最低检测浓度为0.1μg/mL。

2.2.6精密度试验取空白血浆100μL，按“2.2.5”项下方法制备低、中、高3个浓度（茶碱的质量浓度分别为0.4、12.7、25.4μg/mL）的质量控制样品。按“2.2.3”项下方法处理，每一浓度分别于日内连续测定5次及5日间每日测定1次，考察方法的日内和日间精密度，结果RSD满足要求，表明该方法的精密度良好。

2.2.7回收率试验按“2.2.6”项下方法制备低、中、高3个浓度的质控样品。同时水代替空白血浆，配制相应浓度的茶碱溶液，同样进行5个样本分析。质量控制样品与不含血浆样品的比值为回收率。3个样品的回收率分别为：（84.2±3.6）%、（91.0±2.8）%、（86.7±3.9）%。

2.3统计学方法

用PKBP药代动力学软件包分别进行各项药动学参数计算，包括Cmax、Tmax、t1/2、AUC0～∞和CL、MRT，组间试验数据采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.4野2.1.1冶项下两组大鼠茶碱血药浓度的比较

2.4.1两组大鼠茶碱血药浓度-时间曲线合用组和单用组的茶碱的血药浓度—时间曲线见图2。

图2　两组大鼠的茶碱C-t曲线（n=8）

表1　两组大鼠的茶碱药动学参数比较（±s）

表1　两组大鼠的茶碱药动学参数比较（±s）

组别　Tmax（h）　Cmax（mg/L）　AUC0→∞（mg/L·h）　t1/2（h）　Vd/F（L/kg）　MRT（h）单用组（n=8）合用组（n=8）P值1.50±0.53 0.81±0.26 0.01 19.928±2.592 20.756±2.885 0.56 174.347±24.727 162.495±46.153 0.53 3.22±0.58 4.04±1.80 0.24 0.536±0.090 0.715±0.184 0.03 5.93±0.68 5.89±1.31 0.94

2.4.2两组大鼠的茶碱药动学参数比较用PKBP药代动力学软件包，按照二房室模型处理茶碱的血药浓度-时间曲线，以1为权重，其药代动力学特征用统计矩参数表示，结果见表1。

2.5野2.1.2冶项下三组大鼠PT与INR值比较

由图2、表1可知，合用组Tmax较单用组明显提前，Vd/F差异有统计学意义（P＜0.05），而两组的其他参数比较差异无统计学意义。在最后一次灌胃给予华法林1 h后断尾取血，用全自动凝血分析仪（凝固法）测定血浆PT、INR值，未用药组与A、B组比较，PT、INR值比较差异有统计学意义（P＜0.01）；A组与B组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2　三组大鼠的P T与I NR值比较

3　讨论

华法林是20世纪40年代美国Wisconsin大学合成的香豆素类口服抗凝药，在临床抗凝治疗中有着重要的作用，欧美的治疗指南均将华法林作为心房颤动的标准抗凝药物[17]。华法林在体内通过抑制维生素K依赖的凝血因子Ⅱ、Ⅵ、Ⅸ及Ⅹ的合成发挥作用。对映体S-华法林的抗凝作用约为R-华法林的5倍。临床研究表明，华法林的疗效受多种因素影响，其中遗传因素中基因多态性较为明显，主要受CYP2C9（S-华法林）及CYP1A2、CYP3A4（R-华法林）、维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1（VKORC1）的活性影响，其中影响最强的一般认为是CYP2C9和VKORC1[18-19]。但有报道，一些CYP1A2抑制剂与华法林相互作用，可干扰华法林的代谢，导致INR值明显增加[20-21]。氨茶碱为茶碱与乙二胺的复盐，药理作用主要是茶碱、乙二胺增强其水溶性，氨茶碱除扩张支气管外，还有抗炎、免疫调节作用，广泛用于治疗支气管哮喘、阻塞性肺气肿等相关肺疾病。茶碱主要通过CYP450代谢，其中以CYP1A2途径代谢比例最高，占90%左右。因而茶碱常作为CYP1A2的特异性底物[22-25]。本实验选择华法林和氨茶碱相互作用进行考察，主要是因为此两种药物疗效确切，为临床常用品种，特别对一些伴发疾病较多的老年患者，常可见此两种药物的联合使用。同时它们的体内代谢都受CYP1A2活性影响，在体内两种药物更可能发生相互作用，造成不良的影响。

华法林对氨茶碱药动学影响实验中，虽然合用组与单用组Cmax差别不大，但合用组Tmax较单用组提前了近1倍，且Vd/F也较单用组有所增加，提示华法林可能影响茶碱的体内吸收代谢过程。氨茶碱对华法林药效学影响实验选择灌胃给予华法林1 h后断尾取血，主要是考虑氨茶碱在用药0.8～1.5 h后血药浓度最高，最可能影响华法林的药效。实验结果中未用药组（对照组）INR值为0.78～1.21，而单用华法林组INR值为1.11～6.52，进一步验证了华法林抗凝血作用的个体差异较大，提示常规监测PT、INR值的必要性。虽然A组与B组PT、INR值比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但在取血后第2日，合用组大鼠有3只死亡，单用组有1只死亡，分析原因主要是合用组INR高值的大鼠只数较多，提示在华法林和氨茶碱联合使用过程中更要注意个体差异。

氨茶碱或茶碱与华法林联合使用情况下，由于Tmax明显提前，氨茶碱或茶碱血药浓度监测采血时间可能需要提前，特别是在怀疑氨茶碱或茶碱中毒情况下。同时建议合用时，更应密切监测患者的INR值，以便及时发现有严重出血倾向者，调整华法林的用量或及时使用维生素K等措施，将INR值控制在合适的范围内，确保华法林钠安全有效的使用。

志谢：感谢中山大学药学院药物代谢与药动学实验室钟国平老师对本研究药代动力学数据处理给予的帮助！

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Interaction of oral am inophylline and warfarin on the pharmacokinetics and pharmacodynam ics in rats

HE Yong1ZHOU Shuhua1WANG Lie2YANG Shuangming2HUANG Jinbao2WU Yang1
1.Department of Pharmacy,People's Hospital of Chizhou in Anhui Province,Chizhou 247000,China;2.Department of Clinical Laboratory,People's Hospital of Chizhou in Anhui Province,Chizhou 247000,China

[Abstract]Objective To investigate interaction of aminophylline and warfarin on the pharmacokinetics and pharmacodynamics in rats so as to provide experimental evidence for clinical combination therapy.M ethods During the experiment ofwarfarin on the aminophylline pharmacokinetic effects,16 male SD rats were randomly divided into warfarin+ aminophylline combined group(combined group,n=8)and aminophylline group(alone group,n=8).Blood samples of rats in both groupswere collected at different time points after administration.Blood concentration of theophylline was detected by HPLC.Pharmacokinetic parameters of theophylline were derivated by using PKBP pharmacokinetic packages,and the parameters were statistically analyzed.60 male SD ratswere randomly divided into three groups,namely untreated group(n=20),warfarin+aminophylline combined group(group A,n=20)and warfarin group(group B,n= 20)in the experiment of aminophylline on the warfarin pharmacodynamic effects.Blood samples of rats in three groups were collected at the last administered orally 1 h after gavage administration.PT and INR values were determined by automatic coagulation analyzer,and the experimental resultswere statistically analyzed.Results Tmaxof aminophylline of combination group was significantly ahead,therewas statistically significant difference in Vd/F(P＜0.05),while there was no statistically significant difference in other parameters(Cmax,t1/2,AUC0～∞,MRT)(P＞0.05).Compared with the untreated group,PT and INR values of Group A and group B were significantly different(P＜0.05);therewas no significant difference in PT and INR value between group A and group B.However,high value of INR in group A was relatively more.Conclusion When aminophylline or theophylline in combination with warfarin,aminophylline or theophylline blood concentration monitoring sampling time(peak concentration)may be required in advance.Meanwhile INR values should closelymonitor in order to detect patientswith severe bleeding tendency,warfarin dosage can be adjusted immediately or remedialmeasures be taken to ensure safe and effective use ofwarfarin.

[Key words]Aminophylline;Theophylline;Warfarin;Pharmacokinetics;Pharmacodynamics;Drug interaction

收稿日期：（2015-09-09本文编辑：赵鲁枫）

[中图分类号]R969.1；R969.2

[文献标识码]A

[文章编号]1673-7210（2016）01（a）-0049-05