他克莫司处理的未成熟树突状细胞对小鼠炎症性肠病的作用及其机制研究

魏丹芸　　张　洪　　彭　锐　　张　英武汉大学人民医院药学部，湖北武汉　430060



他克莫司处理的未成熟树突状细胞对小鼠炎症性肠病的作用及其机制研究

魏丹芸张洪彭锐张英
武汉大学人民医院药学部，湖北武汉430060

[摘要]目的探讨他克莫司（Tac）处理的未成熟树突状细胞（imDC）对小鼠克罗恩病模型中炎性肠病的作用及其具体的机制。方法体外培养小鼠骨髓来源的树突状细胞（DC），加入Tac处理抑制其成熟，以2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）灌肠法制作克罗恩病模型。将48只小鼠随机分为4组，分别为对照组、模型组、imDC组、Tac-imDC组，每组各12只。对照组给予50%乙醇溶液灌肠，其余三组分别给予TNBS灌肠造模，各组在灌肠前24 h和灌肠后24 h分别经尾静脉输注相应的PBS或者imDC，对照组和模型组经尾静脉输注PBS，imDC组输注1×106个未经Tac处理过的imDC，Tac-imDC组输注1×106个经过Tac处理过的imDC。每天记录小鼠一般情况，7 d后分别行疾病活动指数（DAI）、结肠大体形态损伤指数（CMDI）和结肠病理组织学（TDI）评分，取小鼠结肠组织行酶联免疫吸附试验（ELISA）检测白介素-10（IL-10）、转化生子因子-β（TGF-β）和白介素-17（IL-17）的水平变化。结果相比于对照组，模型组的DAI、CMDI和TDI评分明显升高[DAI：（0.75±0.10）比（5.12±1.05）分；CMDI：（0.70± 0.12）比（6.52±1.18）分；TDI：（0.34±0.03）比（5.53±1.12）分；均P＜0.01]，TGF-β、IL-10水平明显下降[TGF-β：（20.421±2.091）比（14.356±1.756）pg/mL；IL-10：（6.162±0.512）比（4.012±0.469）pg/m；均P＜0.01]，IL-17水平明显升高[（19.232±2.187）比（25.754±3.621）pg/mL，P＜0.01]。相对于模型组，imDC组和Tac-imDC组的DAI、CMDI和TDI评分均显著下降[DAI：（5.12±1.05）比（4.01±0.92）、（3.12±0.81）分；CMDI：（6.52±1.18）比（5.04±1.05）、（3.54± 0.98）分；TDI（5.53±1.12）比（4.00±0.88）、（3.22±0.92）分；P＜0.05或P＜0.01]，而TGF-β、IL-10水平上升[TGF-β：（14.356±1.756）比（16.012±2.012）、（19.002±2.756）pg/mL；IL-10：（4.012±0.469）比（4.956±0.534）、（5.618±0.595）pg/mL；P＜0.05或P＜0.01]，IL-17水平明显下降[（25.754±3.621）比（22.741±3.051）、（20.319±2.654）pg/mL，P＜0.05或P＜0.01]。相对于imDC组，Tac-imDC组的变化更为显著[DAI：（4.01±0.92）比（3.12±0.81）分；CMDI：（5.04±1.05）比（3.54±0.98）分；TDI：（4.00±0.88）比（3.22±0.92）分；TGF-β：（22.741±3.051）比（20.319±2.654）pg/mL；IL-17：（16.012± 2.012）比（19.002±2.756）pg/mL；IL-10：（4.956±0.534）比（5.618±0.595）pg/mL；P＜0.05或P＜0.01]。结论未成熟的树突状细胞能明显缓解小鼠克罗恩病模型中小鼠炎症性肠病，而经过Tac处理的未成熟树突状细胞更能加强其抑制炎症的作用，其机制可能是介导了Th17/Treg轴的偏倚。

[关键词]他克莫司；树突状细胞；小鼠炎症性肠病；克罗恩病模型

树突状细胞（dendritic cell，DC）作为体内最重要的抗原提呈细胞，不仅直接参与机体对外来抗原的免疫反应，而且在诱导免疫耐受中也起着十分重要的作用，其诱导免疫耐受的机制可能是在未成熟的DC （immaturate dendritic cell，imDC）表面低表达主要组织相容性抗原-Ⅱ（MHC-Ⅱ）和共同刺激因子CD80、CD86，缺失这些表面因子后其抗原提呈能力减弱，无法提供幼稚T细胞向效应T细胞转化的第二信号[1]。传统观点认为小鼠克罗恩病模型主要是以辅助性T细胞1（T helper 1 cell，Th1）过度活化为主的免疫失调引起的疾病[2]，但是近来发现辅助性T细胞17（T helper 17 cel，Th17）/调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）轴的失衡在疾病发生和发展方面也起着重要的作用[3]。Tac作为新一代的新型免疫抑制剂，能全面抑制T淋巴细胞的的作用，较环孢素强100倍，在溃疡性结肠炎的治疗中已经初见其效[4]。本实验通过体外培养小鼠骨髓来源的imDC，在培养过程中经过Tac

处理，检测其成熟程度，研究其在缓解小鼠炎症性肠病模型中的作用及其机制。

1　材料与方法

1.1实验动物与试剂

1.1.1动物6～8周龄SPF级雌性bal/c小鼠48只，体重18～22 g，购于武汉大学动物实验中心[许可证号：SCXK（鄂）2014-0004]，饲养于武汉市三医院动物实验中心。

1.1.2试剂胎牛血清购于浙江天杭生物科技股份公司；重组小鼠白细胞介素4（rm IL-4）和重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）购于Peprotech公司；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）购于Sigma公司；三氢-吲哚菁型染料（PE-Cy7）标记的抗鼠CD11c抗体，藻红蛋白（PE）标记的抗小鼠CD80、CD86、MHC-Ⅱ以及同型对照抗体均购于美国BD公司；白介素-10 （IL-10）、白介素-17（IL-17）、TGF-β酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒均购于R&D公司。

1.2小鼠imDC的体外培养和鉴定

1.2.1小鼠骨髓源imDC的获取和培养参考O'Flynn 等[5]的方法，取小鼠完整的股骨和胫骨，离断干骺端后，用1mL注射器针头抽吸PMRI 1640培养基冲洗骨髓，经过滤后加入红细胞裂解液后离心以含10%的胎牛血清PMRI 1640培养基重悬细胞，调整密度为1×106个/mL，分布于六孔板中，培养于37℃5%CO2培养箱中孵育，培养4 h后去除含淋巴细胞的悬液，重新加入新鲜的10%胎牛血清PMRI 1640完全培养基，并添加细胞因子rm IL-4（5 ng/mL）和rmGM-CSF（10 ng/mL）。隔天半量换液，重新加入含细胞因子的新鲜培养基，第6天收获未成熟的DC，而Tac处理的DC则在开始培养DC时加入，浓度为10 ng/mL，换液时加入同样剂量的Tac。

1.2.2imDC的鉴定分别收集两组不同培养方法的DC，离心重悬，在细胞密度为1×106个/mL 100μL的反应体系中分别加入抗小鼠的PE-Cy7-CD11c，PECD80，PE-CD86，PE-MHC-Ⅱ5μL，同时设同型对照，避光孵育半小时后以PBS洗涤两遍，后加入4%多聚甲醛固定后上流式细胞仪检测。

1.3实验分组、模型建立及细胞输注

1.3.1分组将48只小鼠随机分为4组，每组12只，第1组为对照组，以50%乙醇灌肠前后1 d各经尾静脉输注PBS，第2组为模型组，以TNBS灌肠前后24 h各经尾静脉输注PBS，第3组为imDC组，在TNBS灌肠前后24 h各经尾静脉输注1×106个未经Tac处理的imDC。第4组为Tac-imDC组，在TNBS灌肠前后24 h各经尾静脉输注1×106个经过Tac处理过的imDC。

1.3.2小鼠克罗恩病模型的建立按照Eeckhaut等[6]方法，小鼠适应性饲养1周后给予禁食不禁水24 h，模型组、imDC组、Tac-imDC组经腹腔注射戊巴比妥钠（30mg/kg）麻醉后，倒悬位，将直径为0.2mm的聚乙烯管插入肛门约5 cm，缓慢灌入TNBS/50%乙醇混合溶液0.1 mL（1体积TNBS水溶液与1体积无水乙醇混匀），而对照组给予灌入等剂量50%乙醇，拔管后继续保持倒立约1min，放回笼中正常饲养。

1.3.3经尾静脉输注药物在灌肠前24 h和灌肠后24 h经尾静脉输注相应的药物，对照组和模型组输注PBS，imDC组输注未经Tac处理过的imDC，Tac-imDC组输注经Tac处理过的imDC。

1.4观察指标与评价方法

1.4.1小鼠疾病活动指数（DAI）观察及评分根据相关标准[7]行小鼠DAI评分，观察小鼠的精神状态，大便的性质，有无血便，每天记录小鼠的的体重变化情况。0分：大便性质正常，无血便及隐血便，体重无下降；1分：大便松散，隐血便阳性弱阳性，体重下降＞0～5%；2分：大便松散，隐血阳性，体重下降＞5%～10%；3分：呈稀便，肉眼血便，体重下降＞10%～15%；4分：呈稀便，大量肉眼血便，体重下降＞15%。DAI评分=大便性质评分+血便评分+体重变化评分。

1.4.2小鼠结肠大体形态损伤指数（CMDI）观察及评分造模后第7天处死小鼠后，取全段结肠组织在解剖显微镜下观察溃疡及炎症情况，根据Wallace等[8]标准进行评分：0分：基本正常；1分：无溃疡，局部可见充血；2分：可见溃疡，但无充血；3分：仅1处溃疡和炎症；4分：2处或更多处的溃疡和炎症；5分：溃疡长于2 cm；6～10分：大于2 cm的溃疡，每增加1 cm 加1分，有轻度粘连时（结肠较易与周围组织剥离）加1分，粘连较严重时加2分，

1.4.3小鼠结肠病理组织学指数（TDI）观察及评分在解剖显微镜下取病变较严重处，用4%多聚甲醛固定后行石蜡包埋，切片和HE染色，根据Dieleman等[9]标准如下：炎症细胞浸润：无为0分，轻度为1分，中度为2分，重度为3分；浸润深度无为0分，黏膜层为1分，黏膜下层及肌层为2分，结肠全层为3分；溃疡深度：无为0分，上皮层为1分，黏膜层为2分，黏膜肌层为3分。DAI评分=炎症细胞浸润程度+浸润深度+溃疡深度评分。

1.4.4ELISA法测定小鼠结肠组织TH17/Treg相关细胞因子IL-17和TGF-β、IL-10的水平变化将结肠组织放在冰的PBS上冲洗，滤纸拭干后称取约10 mg结肠组织，加入1 mL PBS（pH：6.0，内含1μg抑肽酶和亮肽素胃酶抑素A），用眼科剪剪碎后放入匀浆器进行匀浆，4℃，12 000 r/min离心20min，取上清液，按ELISA试剂盒说明书检测IL-17和TGF-β、IL-10的浓度。

1.5统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1imDC的鉴定

2.1.1形态学观察培养4 h可见大量的圆形贴壁细胞，均匀分布，见图1；2 d后有大量的集落形成，开始有微小发丝样突起产生，见图2；5 d后细胞逐渐从集落脱离，呈典型的树突状形态，见图3；第7天imDC呈毛刺样突起，见图4。

图1　倒置显微镜下观察培养4 h的树突状细胞形态（2 0 0×）

图2　倒置显微镜下观察培养2 d的树突状细胞形态（2 0 0×）

图3　倒置显微镜下观察培养5 d的树突状细胞形态（4 0 0×）

图4　倒置显微镜下观察培养第7天树突状细胞的形态（4 0 0×）

2.1.2细胞表面标志物的流式细胞仪检查测得细胞表面表达DC的特异性表面标志物CD11c的表达率为85%，未经Tac处理过的DC表达共同刺激因子CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达率分别为31.6%、25.4%和51.0%，而经过Tac处理过的DC表达共同刺激因子CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达率分别为15.5%、10.3%和31、7%，符合imDC的表型，与Gao等[10]结果一致。见图5。

2.2实验小鼠指标的评价

根据上述“1.4”项下所描述的方法和标准对每组小鼠进行评分并记录，相比于对照组，模型组的DAI、CMDI、TDI评分明显升高，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）。相比于模型组，imDC组和Tac-imDC组的DAI、CMDI、TDI评分明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。相比于imDC组，Tac-imDC组上诉评分降低更加明显，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。见表1。

2.3小鼠结肠组织相关因子的检测

相比于对照组，模型组的小鼠结肠组织细胞因子IL-17水平明显升高，而细胞因子TGF-β和IL-10水平明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。相比于模型组，imDC组和Tac-imDC组的IL-17水平明显降低，而TGF-β和IL-10水平明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。相比于imDC组，Tac-imDC组的IL-17、TGF-β、IL-10水平降低的更为显著，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见表2。

imDC：未成熟树突状细胞；Tac-imDC：经过他克莫司处理过的imDC图5　未经T a c处理后和经过T a c处理后的i m DC的表型

3　讨论

DC作为机体内最重要的专职抗原提呈细胞，决定着机体是产生免疫耐受还是免疫反应，其表面的共同刺激分子CD80和CD86能够与T细胞表面的共同刺激分子细胞毒性T细胞相关蛋白-4（CTL-4）特异性结合来激活下游信号，从而使幼稚T细胞向效应T细胞转化，导致免疫的激活[11]。DC表面的另外的表面分子MHC-Ⅱ起着识别抗原的作用，与抗原结合后将抗原信息提供给T细胞，诱导免疫反应[12]，目前达成共识的是未成熟的DC缺乏共同刺激分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ，从而诱导T细胞的失能，导致免疫耐受，而成熟的DC高表达上述分子，提供T细胞活化的信号，从而导致免疫的激活[13]。

表1　各实验组考察指标项评分（分，±s）

表1　各实验组考察指标项评分（分，±s）

注：对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05；##P＜0.01；与imDC组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；DAI：疾病活动指数评分；CMDI：结肠大体形态损伤指数评分；TDI：结肠病理组织学评分；imDC：未成熟树突状细胞；Tac-imDC：经过他克莫司处理过的imDC

组别　　例数　DAI　CMDI　TDI对照组模型组imDC组Tac-imDC组12 12 12 12 0.75±0.10 5.12±1.05*4.01±0.92#3.12±0.81##▲0.70±0.12 6.52±1.18*5.04±1.05##3.54±0.98##▲▲0.34±0.03 5.53±1.12*4.00±0.88##3.22±0.92##▲

表2　各组小鼠结肠组织I L-1 7和I L-1 0、TGF-β细胞因子含量（pg/mL，±s）

表2　各组小鼠结肠组织I L-1 7和I L-1 0、TGF-β细胞因子含量（pg/mL，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与imDC组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；IL-17：白介素-17；TGF-β：转化生子因子β；IL-10：白介素-10；imDC：未成熟树突状细胞；Tac-imDC：经过他克莫司处理过的imDC

组别　　例数　IL-17　TGF-β　IL-10对照组模型组imDC组Tac-imDC组12 12 12 12 19.232±2.187 25.754±3.621*22.741±3.051#20.319±2.654##▲20.421±2.091 14.356±1.756*16.012±2.012#19.002±2.756##▲▲6.162±0.512 4.012±0.469*4.956±0.534##5.618±0.595##▲▲

幼稚T细胞在激活后分化为不同的效应T细胞，分为Th1、Th2、Th17、Treg细胞[14]，传统观点认为，克罗恩病的主要致病机制为Th1细胞的过度活化和数量增多，分泌炎症因子γ干扰素，导致免疫紊乱。但后来一系列实验发现Th17和Treg细胞轴的偏倚也是导致克罗恩病的重要发病机制[15-17]。Th17以分泌IL-17而命名，IL-17具有强大的募集和激活中性粒细胞的能力，能诱导激活T细胞和刺激成纤维细胞、巨噬细胞和上皮细胞产生多种促炎物质，引起局部炎症细胞的浸润，组织的破坏[18]，而Treg分泌的细胞因子IL-10 和TGF-β，IL-10不仅仅能抑制T细胞的增值，而且还能抑制其他免疫细胞，如自然杀伤细胞、巨噬细胞和单核细胞的活化，而TGF-β对于T细胞、B细胞、巨噬细胞和其他免疫性细胞也起着抑制其增值、分化的作用[19]。在以往的实验中，通过尾静脉输注未成熟的DC，虽然在一定程度上减轻了炎性反应，但还是无法完全消除炎性反应，原因可能是在体外未成熟的DC在输入小鼠体内后，在复杂的微环境中特别是在炎症缓解下会转化为成熟的DC，甚至有可能加重炎性反应[20]。

笔者发现，通过Tac处理过的imDC，其表面共同刺激分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ表达的量较未经Tac处理过的imDC更低，将经Tac处理过的imDC输入小鼠体内后发现，相对于未成熟组，其克罗恩病的疾病指数较未经Tac处理组明显降低，说明在未成熟的DC经Tac处理后在小鼠体内更能保持未成熟的状态。为了进一步探讨其imDC诱导耐受机制，本实验采用ELISA法检测了结肠组织Th17/Treg相关细胞因子，发现Tac处理组其Th17相关因子IL-17明显低于未经Tac处理组和模型组，而经Tac处理组其Treg相关因子IL-10和TGF-β明显高于未经Tac处理组和模型组，说明经Tac处理的imDC能使体内Th17相关因子IL-17处于较低水平，使Treg相关因子IL-10 和TGF-β处于较高水平，可能imDC介导了体内Th17/ Treg免疫偏倚，并且经过Tac处理过的imDC加强了这种偏倚，从而使免疫反应更加减轻了。

本实验成功制作出克罗恩病模型，并通过实验证明经过Tac处理的imDC更能加强其抑制炎症的作用。其机制可能介导了TH17/Treg轴的偏倚，从而揭示了经Tac处理的imDC抑制克罗恩病小鼠模型炎症进展的分子基础，这为如何保持imDC稳定状态从而更加安全地减轻克罗恩病炎症进程提供了实验数据，也为其在临床中的应用提供了新的方法。

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Research of the function and mechanism of Tacrolimus-treated dendritic cells on mouse inflammatory bowel disease

WEIDanyun ZHANG Hong PEN Rui ZHANG Ying
Department of Pharmacy,Renmin Hospital ofWuhan University,Hubei Province,Wuhan 430060,China

[Abstract]Objective To investigate the effect of Tacrolimus-treated immture dendritic cells(imDC)on the Crohn's micemodels induced by 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)and the actionmachnasim.M ethods Dendritic cells were obtained from the murine bone marrow and treated with Tac to maintain its immature,and Crohn's mice models were induced by TNBS.48 mice were randomly divided into four groups:control group,model group,imDC group and Tac-imDC group,evey group contains 12 mice.The other three groups were iuduced to Crohn'smodels by instillation of the 50%ethanol/TNBS enema.And the control group was instilled 50%ethanol enema.24 hours before and after instill enema,PBS or cells was injected via tail vein.Control group and model group were injected PBS;the imDC group were injected DC that did not treated by Tac;the Tac-imDC group were injected imDC that treated by Tac.Then the general situation ofmice were observed.After one week,the disease activity indexbook=26,ebook=29(DAI),colon macroscopic damage index(CMDI)and tissue damage index(TDI)were evaluated;the colon levels of interleukin-17(IL-17),interleukin-10(IL-10),transforming growth factor-β(TGF-β)were determined by enzymelinked immunosorbent assay(ELISA).Results Compared with the control group,scores of DAI,CMD an TDI inmodel group were significantly increased[DAI:(0.75±0.10)vs(5.12±1.05)scores,CMDI:(0.70±0.12)vs(6.52±1.18)scores; TDI:(0.34±0.03)vs(5.53±1.12)scores;all P＜0.01].And the colon tissue levels of IL-10,TGF-βwere significantly decresed[TGF-β:(20.421±2.091)vs(14.356±1.756)pg/mL;IL-10:(6.162±0.512)vs(4.012±0.469)pg/mL;all P＜0.01].But the level of IL-17 was significantly increased[(19.232±2.187)vs(25.754±3.621)pg/mL,P＜0.01].Compared with model group,the scores of DAI,CMDI,TDI in imDC and Tac-imDC group were significantly decreased [DAI:(5.12±1.05)vs(4.01±0.92),(3.12±0.81)scores;CMDI:(6.52±1.18)vs(5.04±1.05),(3.54±0.98)scores;TDI: (5.53±1.12)vs(4.00±0.88),(3.22±0.92)scores,P＜0.05 or P＜0.01].The colon levels of IL-10,TGF-βin imDC group and Tac-imDC group were incresed significantly[TGF-β:(14.356±1.756)vs(16.012±2.012),(19.002±2.756)pg/mL, IL-10:(4.012±0.469)vs(4.956±0.534),(5.618±0.595)pg/mL,P＜0.05 or P＜0.01],and the level of IL-17 was decresed significantly[(25.754±3.621)vs(22.741±3.051),(20.319±2.654)pg/mL,P＜0.05 or P＜0.01].Butwhen compared with imDC group,the changes were more significantly[DAI:(4.01±0.92)vs(3.12±0.81)scores;CMDI:(5.04±1.05)vs (3.54±0.98)scores;TDI:(4.00±0.88)vs(3.22±0.92)scores;TGF-β:(22.741±3.051)vs(20.319±2.654)pg/mL;IL-17: (16.012±2.012)vs(19.002±2.756)pg/mL;IL-10:(4.956±0.534)vs(5.618±0.595)pg/mL;P＜0.05 or P＜0.01].Conclusion ImDC can significantly attenuates intestinal inflammation in Crohn'smicemodels and the effection can be enhanced by Tac.Themechanism may be involved in the shiftof Th17/Treg axis.

[Key words]Tacrolimus;Dendritic cells;Inflammatory bowel disease;Crohn'smicemodels

收稿日期：（2015-08-12本文编辑：任念）

[通讯作者]张洪（1962.5-），男，教授，硕士生导师；研究方向：消化系统疾病治疗药物的药剂学与药理学研究。

[作者简介]魏丹芸（1990.4-），女，硕士；研究方向：个体化给药。

[中图分类号]R574

[文献标识码]A

[文章编号]1673-7210（2016）01（a）-0025-06