健康直系亲体靶向DC-CIK细胞的制备及在恶性肿瘤免疫治疗中的应用*

武警陕西省总队医院(西安710054)　刘征丽　张　潍　张学成　赵　花　阎　琨　张　菊



健康直系亲体靶向DC-CIK细胞的制备及在恶性肿瘤免疫治疗中的应用*

武警陕西省总队医院(西安710054)刘征丽张潍△张学成赵花阎琨张菊#

摘要目的：探讨健康直系亲体负载肿瘤干细胞抗原的靶向DC-CIK细胞的制备方法及对恶性肿瘤患者的治疗价值。方法：43例恶性肿瘤患者，用智能单采机采集健康直系亲体的外周血单个核细胞，其中贴壁细胞经体外诱导产生树突状细胞(DC)，悬浮细胞经体外诱导产生CIK，DC负载不同肿瘤干细胞抗原制备靶向DC 细胞，将靶向DC与CIK细胞共培养制备靶向DC-CIK，检测靶向DC-CIK细胞表面分子的表达及细胞增殖情况，并将靶向DC-CIK分6次回输给43例患者，治疗3个疗程后，结合影像学等检查综合评价临床治疗的疗效，同时观察不良反应。结果：靶向DC 细胞与CIK细胞共培养后，可明显刺激CIK细胞的增殖，同时CD3+CD8+细胞，CD56+及CD3+CD56+细胞的含量明显增加，43例恶性肿瘤患者接受健康直系亲体靶向DC-CIK细胞输注，PR17例，SD 25例，PD 1例，临床疗效明显，无不良反应。结论：健康直系亲体靶向DC-CIK细胞应用于恶性肿瘤患者效果确切、无明显不良反应。

主题词肿瘤 细胞因子诱导杀伤细胞分子靶向治疗免疫疗法

免疫治疗正在成为晚期恶性肿瘤的有效手段，但由于中晚期恶性肿瘤患者，曾接受过手术、化疗或放疗，对其自身情况、血液细胞均有不同程度影响，其自体的单核细胞，无论从数量和质量上均较健康人明显减低[1-2]。恶性肿瘤的增殖、侵袭、转移及复发过程中肿瘤干细胞发挥着决定性的作用[3-4]。我院2014年4月至2015年8月采用患者的直系健康亲属提供单核细胞，针对恶性肿瘤干细胞进行特异免疫治疗，培养出恶性肿瘤靶向DC-CIK细胞应用于中、晚期恶性肿瘤患者取得了良好的效果，现报告如下。

对象与方法

1对象经病理或细胞学检查确诊为中、晚期肿瘤患者，宫颈癌33例，肺癌10例，女36例，男7例，年龄 25～81岁。均在行细胞治疗之前进行过手术、放化疗，手术、放化疗与细胞治疗间隔在 4 周以上。所有患者Karnofsky评分≥60分，治疗前肝、肾功能及血常规正常，预计生存期>3个月，符合细胞免疫治疗要求，自愿并签署知情同意书，均采用健康直系亲体DC-CIK 细胞免疫治疗方法。

2主要试剂与仪器重组人细胞因子( rhGM-CSF，rhIL-4，rhTNF-α，rhIFN-γ，rhlL-2) 均购自Peprotech公司; 宫颈癌、肺癌干细胞抗原购自西安瑞泽生物技术公司；小鼠抗人CD3 mAb购自Bioscience公司，FITC标记的小鼠抗人CD3抗体、FITC标记的小鼠抗人CD8抗体、PE标记的小鼠抗人CD56抗体购自Biolegend公司，流式细胞仪购自BD PharMingen公司;生物超净台及CO2培养箱均为上海苏净实业有限公司产品。

3健康直系亲体采血前检查健康直系亲体在进行细胞采集之前，检验证明各型肝炎病毒、HIV、梅毒螺旋体等均为阴性，同时排除自身免疫性疾病(如慢性淋巴性甲状腺炎、溃疡型结肠炎、重症肌无力、多发性硬化病、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和糖尿病等)，有证明健康供血者是患者的直系亲属资料。

4外周血单个核细胞采集在无菌条件下，由专职人员使用全自动智能血细胞分离机，采集供血者外周血单个核细胞(PBMC)，细胞数量达到 1×109以上，单采管及所有耗材均为一次性。

5细胞培养诱导及鉴定①树突状细胞(DC)的培养诱导：单采获得的PBMC，加入到CIK细胞培养液中；在37℃，50 ml/L CO2孵箱中贴壁2 h，其中贴壁细胞为DC前体细胞，悬浮细胞为CIK前体细胞，收集悬浮细胞以备CIK细胞培养。在贴壁细胞中加入浓度为100 ng/ml的rhGM-CSF和rhIL-4，隔日等量补充细胞因子。培养第5天的DC中加入终浓度为1μg/ml的肿瘤干细胞抗原致敏DC，第7天收集成熟的靶向DC。②CIK细胞扩增培养及表型鉴定：悬浮细胞加入到CIK细胞培养液中，加入浓度为1000 U/ml的IFN-γ，于50 ml/L CO237℃培养箱内培养24 h后加入终浓度均为1000 U/ml的IL-2及1μg/ml小鼠抗人CD3 mAb，继续50 ml/L CO237℃培养箱内培养，隔日半量加液，并补充IL-2；在CIK细胞培养的第7天与靶向DC混合共培养，第15天时收集靶向DC-CIK细胞，取部分细胞以流式细胞仪测定CD3+CD8+，CD56+和CD3+CD56+细胞的比例，应用计数仪计数CIK细胞的增殖情况。

6免疫治疗方案收集扩增第15天的靶向DC-CIK细胞，检测活细胞比例>95%，1500 r/min生理盐水洗涤2次，检定无细菌及真菌污染，内毒素检测合格≤10 EU/ml，将细胞悬浮于250 ml生理盐水中静脉滴注，1次/d，每次回输的细胞数量不低于5×109，避光条件下将细胞回输完毕。连续回输6 d为1个疗程，每隔30 d治疗1个疗程，共3个疗程。

7观测指标及疗效评估观测指标包括瘤体变化、生存期、生活质量、不良反应等。参照实体瘤疗效RECIST判定标准: 以患者治疗前及治疗后3个月CT及B超进行对照比较，以完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)、进展(PD) 进行疗效评定，有效=CR+PR。CR：所有靶病灶消失，无新病灶出现，且肿瘤标志物正常，至少维持4周;PR：靶病灶最大径之和减少30%，至少维持4周；SD：靶病灶最大径之和缩小未达PR，或增大未达疾病进展；PD: 靶病灶最大径之和至少增加 20%，或出现新病灶，如仅一个靶病灶的最长径增大20%，而记录到的所有靶病灶的最长径之和增大未达20%，则不评为PD。每个患者在治疗后24 h内观察过敏反应和其他毒性反应，治疗后每2周行血常规、肝肾功能，心电图检查。以患者主诉为依据记录睡眠、食欲、疼痛及体力状况。

结果

1细胞培养形态观察及表型鉴定DC细胞随培养时间的延长逐渐呈现出树枝状等多种形态。加入肿瘤干细胞抗原致敏的DC细胞体积显著增加，DC细胞内粗颗粒显著增加，成熟速度与比例加大，逐渐成熟悬浮，培养第7天时不需细胞刮铲即可收集。CIK细胞自培养第6天开始，增殖增快，数量增多，形成集落，而与肿瘤干细胞抗原致敏的DC细胞共培养后，增殖明显快，体积增大，细胞内颗粒变粗，第14天时，靶向 DC-CIK细胞扩增达7～10×1010。靶向DC-CIK细胞CD3+CD8+和CD3+CD56+，CD56+的表达均在30%以上。

2疗效43例恶性肿瘤患者先后接受了3个疗程健康直系亲体靶向DC-CIK细胞治疗，无CR病例，PR17例，SD 25例，PD 1例，临床疗效明显。一般状况，如睡眠、饮食、疼痛及体力状况等均有明显改善者42例，占97.67%；输注后夜间过度兴奋、不能安静入睡者1例，占2.33%，其原因有待探讨。

3不良反应43例恶性肿瘤患者，发热7例，出现寒战、发热、疲乏、无力、关节肌肉酸痛等不适占16.28%，但均在24 h内自行消退。未见其它不良反应，所有患者随访时间均超过3个月。

讨论

我国恶性肿瘤患病率和病死率逐年增加，且患者日益年轻化。近年肿瘤免疫治疗取得显著进步，DC/CIK细胞免疫疗法已成为肿瘤治疗的重要手段[5-6]。

树突状细胞(DC)是体内最强的抗原递呈细胞，CIK是外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子培养激活后获得的非MHC限制性、对肿瘤细胞具杀伤毒性的NK样T细胞，兼具T淋巴细胞及NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点，是一群以CD3+CD56+T为主效应细胞包括α/βT细胞，γ/δT细胞的异质细胞，高效、广谱杀伤、非MHC限制。DC-CIK细胞两者联合能有效清除肿瘤患者残存的肿瘤细胞，防止肿瘤复发进展，是目前临床过继免疫治疗中最有效的效应细胞[7-9]。

DC-CIK细胞主要来源于外周血单个核细胞，恶性肿瘤中、晚期患者自身免疫功能低下，且均接受过放、化疗，其自身的单个核细胞质量和数量会有一定程度的降低。我们采用患者的直系健康亲属提供的单个核细胞的质量和数量均较肿瘤患者优良，其细胞活性强、数量多易于培养，易于增殖；本研究用肿瘤干细胞抗原刺激DC细胞，DC细胞捕获加工的平时隐蔽的肿瘤抗原，形成肽-MHC分子复合物，递呈给T细胞，从而启动抗原特异性CTL反应；在肿瘤干细胞抗原激活物中还含DC协同共刺激分子(B7-1、B7-2等)提供T细胞活化所必须的第二信号，启动了特异和非特异免疫应答，增加了CIK细胞的扩增倍数；增强了CIK肿瘤杀伤效力。因此，对于中、晚期恶性肿瘤患者，限于自身情况难以提供优良的单个核细胞以用来培养DC-CIK细胞，应用直系亲属的单个核细胞，应用肿瘤干细胞抗原刺激获得靶向DC-CIK细胞对于维持肿瘤稳定不进展，缓解患者病痛与不适，提高其生活质量，延缓寿命具有重要的临床应用价值。

参考文献

[1]Couzin-Frankel J.Breakthroughof theyear 2013.Cancer immunotherapy[J].Science，2013，342(6165)：1432-1433．

[2]王琦，任秀宝，蒋敬庭.肺癌免疫细胞治疗临床转化的研究进展[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2015，22(3)：375-379.

[3]唐家平，李晋，李锦毅.胃癌干细胞抗原负载的DC-CIK对胃癌细胞的杀伤活性[J].肿瘤防治研究，2013，40(10)：917-920.

[4]李锦军，顾健人.癌干细胞研究进展[J].生命科学，2006，18(4)：333-338.

[5]李冰，郑秋红.DC -CIK细胞联合化疗治疗晚期非小细胞肺癌的临床探讨[J].黑龙江医学，2011，35(1)：4-7.

[6]夏禾爱，郝建峰，陈玲，等.DC-CIK细胞的制备及其对恶性肿瘤的疗效观察[J].现代肿瘤医学，2013，21(10)：2194-2197.

[7]董毅，朱太岗，李月红，等.CIK细胞与DC-CIK细胞抗肿瘤效应的对照研究[J].中华全科医学，2011，9(12)：1844-1848.

[8]艾军，白引苗，张超，等.CIK细胞的生物学特性及荷瘤鼠体内分布特点研究[J].中国免疫学杂志，2010，26(7)：606-609.

[9]罗虎，周向东.CIK细胞及其在肺癌治疗中的研究进展[J].中国肺癌杂志，2011，14(12)：954-958.

(收稿：2015-09-10)

Therapeutic efficacy of dendritic cells pulsed by antigen from cancer stem cells in combination with CIK cells of immediate children health on advanced cancer

The Armed Police Corps Hospital of Shaanxi Province(Xi’an 710054)

Liu ZhengliZhang WeiZhang Xuechenget al

ABSTRACTObjective: To investigate the clinical efficacy of dendritic cells( DCs) sensitization by antigen from cancer stem cells in combination with cytokine-induced killer (CIK) cells on patients with advanced cancer and detect their immune functions and adverse effects.Methods: The study analyzed retrospectively 43 patients with advanced cancer admitted in our department．Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from Immediate children health of the above patients．Adherent cells were cultured to produce DCs．The DCs were pulsed with antigens from cancer stem cells to produce target DCs.T lymphocytes were cultured to prepare CIK．The target DCs was co-cultured with CIK to produce target DC-CIK，and then the phenotypes of target DC-CIK were evaluated.The target DC-CIK cell proliferation was determine，too.The 43 patients received the immunotherapy of target DC-CIK for 3 circles.After treatment，the changes of T cell subtypes and cytokines released in the peripheral blood were evaluated．The therapeutic outcomes were evaluated．The adverse effects were also observed.Results: CIK cell proliferation was significantly enhanced after co-cultured with target DCs．Meanwhile，the percentages of CD3+CD8+ cells， CD56+ and CD3+CD56+cells went up significantly．Clinical responses of the target DC-CIK treatment group were good．No severe adverse effects were seen in the patients．Conclusion：DCs derived from PBMCs of Immediate children health of advanced cancer patients harboring antigens from cancer stem cells can differentiate into mature DCs，which facilitate the proliferation of CIK cells．The targrt DC-CIK therapy improves the immune status of patients with advanced cancer．

KEY WORDSNeoplasmsCytokine-induced killer cellsMolecular targeted therapyImmunotherapy

【中图分类号】R730.51

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.02.017

*陕西省自然科学基金面上项目(2014JM4117)

△第四军医大学西京医院妇产科

#第四军医大学药学系基因诊断技术研究所