小麦单倍体育种方法及其研究进展

崔婷，李亚莉，乔麟轶，郭慧娟，董艳辉，任永康，唐朝晖

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031；3.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030031）

小麦单倍体育种方法及其研究进展

崔婷1，李亚莉2，乔麟轶3，郭慧娟3，董艳辉2，任永康3，唐朝晖2

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031；3.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030031）

单倍体育种技术为小麦新品种选育提供了重要的技术保障，有利于缩短育种年限，加速育种进程，提高选择效率，对于遗传研究具有重要意义。小麦单倍体育种的方法主要有：离体培养、化学诱导、花粉诱导、异源细胞质诱导等，对这些方法的影响因素及其研究进展进行了阐述。

小麦；离体培养；花粉诱导；化学诱导；异源细胞质诱导

单倍体育种比常规育种有突出的优势，可以缩短育种年限，提高育种效率[1]。1964年，A D伯格纳首先在曼陀罗中发现了单倍体植株，之后逐渐有学者发现了一系列自发产生的单倍体。自发产生单倍体植株的途径主要有孤雌生殖、孤雄生殖和无配子生殖，产生单倍体植株的频率很低，其中，孤雌生殖产生的单倍体约为0.1%，孤雄生殖产生的单倍体约为0.01%，有的甚至在1×10-5以下[2]。因此，许多人工诱导单倍体的方法问世。人工诱导单倍体的方法可以极大程度地提高单倍体产生的频率。

笔者综述了人工诱导小麦产生单倍体的主要方法及其研究进展，以期为后期的相关研究提供理论参考。

1 小麦单倍体育种方法

1.1 离体培养法

1.1.1 花药培养我国自20世纪70年代开始进行花药培养育种研究，目前已取得重大成就。在花药培养诱导单倍体研究的过程中，成功实现了单倍体育种与常规杂交育种以及远缘杂交育种、转基因技术相结合，并逐步发展成一套较为完善的育种技术体系[3]。花药培养诱导小麦单倍体受多种因素限制。张再君等[4]在研究中比较了C17培养基和癸培养基对花药培养的影响，结果表明，C17培养基的单倍体诱导率较高，而癸培养基的愈伤组织质量较优。宋运贤等[5]同样对C17和癸这2种培养基进行了比较研究，结果发现，C17培养基诱导得到的愈伤组织分化率以及总体愈伤组织质量都高于癸培养基，并认为这可能是受高浓度的Zn2+影响，但其影响机制并不明确。李新华[6]使用3种不同培养基进行花药组织培养，结果表明，190-2比Potato-2和W14可获得较多的愈伤组织。

基因型对小麦花药的培养也有明显的影响。白延红[7]研究结果表明，基因型对小麦花药的培养能力有显著的影响，由于基因型的不同，97×新抗12的花药愈伤组织诱导率是新抗12×89A21的5倍。Saidi等[8]将16个硬粒小麦栽培品种作为材料，进行花药培养，不同品种间的出愈率相差很大，最高达25.37%，最低3.17%。蔡正云等[9]研究显示，单一亲本相同、另一亲本不同时，愈伤诱导率、绿苗分化率及白苗分化率均有很大差异；同时证明了细胞质可能对诱导率起一定作用。

此外，低温预处理有利于提高花药培养效率，处于不同发育时期的花药受低温处理后，其效应有所不同；小麦基因型不同，低温预处理的最佳时间也会有所差异；处理方法也会影响其效应[10]。宣朴等[11]以12个小麦杂交组合的F2为材料进行研究，结果发现，处理效应最佳的发育阶段是转愈伤组织初期，分别用4，6℃低温处理1～3 d，从而提高绿苗分化率，整体提高育种的效率。

1.1.2 花粉培养其也称为小孢子离体培养，此方法是在花药离体培养的基础上逐步发展起来的[12]。与花药培养相比，小孢子培养没有经历愈伤组织阶段，在一定程度上避免了孢子体变异所造成的农艺性状退化，不仅在很大程度上提高了单倍体的产生率，同时也可以减少白化苗[13]。Gustafson等[14]通过测定分离后的小孢子活力对振荡、漂浮、离析和搅拌4种分离方法进行了比较，研究认为，最佳的方法是振荡，此外还发现，在培养基中加入未成熟子房，可以提高胚胎的发生率。Mejza等[15]进一步研究认为，子房对小孢子有看护作用，小孢子胚胎的形成是子房的生物功能，其作用机制并不明确。Scott等[16]对含有不同组合糖分的培养基进行对比，结果显示，只含麦芽糖的培养基可成功诱导小麦花粉，其他培养基的小孢子则未能成功发育。朱宏等[17]用含有不同浓度蔗糖的W4-1，W4-2，W4-3，W4-4培养基对3种小麦双核期花粉进行培养，结果显示，蔗糖浓度为3%的培养基最适于花粉细胞的分裂。此外，一定时间的低温预处理也可以促进花粉细胞的分裂。较好的处理条件是7℃处理6～12 d。Tianci等[18]研究认为，由花粉培养获得的纯系群体在小麦育种的研究中有很大的应用潜力。

1.1.3 子房、胚珠培养将小麦还未受精的子房或胚珠离体培养，从而得到单倍体植株。Jonson等研究认为，相对于来自小孢子的单倍体，由大孢子产生的单倍体更具有活力[19]。子房、胚珠离体培养解决了某些植物较难用花药培养获得单倍体的问题[20]。20世纪70年代，我国首次出现了离体培养未授粉子房，从而获得单倍体植株[21-22]。随后，张素芳等[23]逐步开始对小麦“三系”子房进行组织培养，并且成功获得了单倍体植株。后来由于该培养体系比较复杂而逐渐被淘汰[24]。

1.2 花粉诱导法

1.2.1 异种属花粉延迟授粉法该方法并不是使小麦卵细胞受精，而是通过授粉刺激卵细胞单性发育。成熟的卵细胞已经失去受精能力，但授粉后花粉管仍会发育，从而刺激卵细胞发生分裂，进行孤雌生殖。胡启德等[25]分别用圆锥小麦、硬粒小麦和黑麦的花粉对普通小麦进行延迟授粉，其F1孤雌生殖，诱导率最高可达6.7%。李德炎[26]研究表明，小麦去雄后延迟7 d授粉，诱导效果最好。贾静鸾等[27]将普通小麦品种间杂种F1作母本，用黑麦和硬粒小麦授粉，结果发现，去雄后8 d授粉效果最好。杜连恩等[28]研究认为，去雄后延迟7～9 d授粉，诱导效果较好。

1.2.2 辐射花粉授粉此方法是指用X，γ，32P，60Co等射线或紫外线照射花粉后给去雄母本授粉，诱导小麦发生孤雌生殖[12]。李德炎[26]用X射线照射花粉后给一粒小麦授粉，其单倍体诱导率可达17.6%。胡启德等[25]用60Co-γ射线照射花粉，其诱导率可达7.5%。赵世绪等[29]研究认为，精子受到辐射后，失去了受精能力，但花粉管照常萌发，从而刺激卵细胞分裂，产生了单倍体；如果受精不完全，则会产生非整倍体。

目前，也有许多学者通过辐照雌配子体诱发孤雌生殖产生单倍体，该项研究在以后的育种工作中可以进一步深入[30]。

1.2.3 染色体消除型远缘花粉授粉Barclay[31]在1975年首先报道了以球茎大麦为父本，与普通小麦进行属间杂交，结果父本染色体消失，从而产生了小麦单倍体。此后，许多研究先后报道，玉米[32-33]、高粱[34]、珍珠粟[35]、类玉米（即大刍草）[36]、鸭茅状摩擦禾[37-38]等与普通小麦杂交，也可以产生小麦单倍体。这些研究打破了小麦只能和小麦族内种间进行杂交的局限。

到目前为止，有很多学者对染色体消失诱导单倍体的各种影响因素进行了研究。陈新民[39]用不同品种小麦与玉米进行杂交，研究认为，不同小麦基因型对单倍体得胚率无显著影响；同时也表明，粗山羊草D型细胞质和普通小麦细胞质对小麦×玉米得胚率无明显影响。赵翠荣等[40]研究发现，不同杂交组合，其后代单倍体胚的萌发率和成苗率间存在极显著差异，表明小麦基因型是影响单倍体得胚率的重要因素。还有研究发现，对单倍体诱导的最佳温度为白天22℃，夜晚17℃；最佳光合有效辐射为1 000 mol/（m2·s），16 h/d[41]。连续阴雨天造成的极端寡照，也会显著降低小麦单倍体胚的得胚率[42]。此外，湿度也会影响单倍体的得胚率和出苗率，有研究表明，低湿度下产生的单倍体胚数是高湿度的2倍[41]。

1.3 异源细胞质诱导法

20世纪中期，Kihara[43]研究发现，普通小麦的核和某些山羊草的细胞质组成的核质杂种，可以高频率地产生单倍体。对于异源细胞质诱导产生单倍体的细胞来源，许多学者已经进行了研究。孙善英[44]研究结果表明，单倍体细胞来源于无配子生殖。张改生[45]用有芒的不育系和无芒的父本进行杂交，再用无芒的不育系和有芒的父本进行杂交，观察其后代证实，单倍体细胞由胚囊中的细胞发育而成。该方法诱导产生单倍体具有频率高、方法简单、产生的单倍体种子均能正常发育，生长良好、容易加倍等优点[46]。

1.4 化学诱导法

化学诱导即用化学药剂处理去雄后的柱头或子房，刺激卵细胞分裂。目前，主要使用的诱导剂有：PCPA，DMSO，KT，NAA，2，4-D，TRTA，GA3，DMSO＋对氯苯氧乙酸，DMSO＋GA3，DMSO＋KT，DMSO＋KT＋邻氯苯氧乙酸，DMSO＋NAA和甲苯胺蓝等[47]。王金玲等[48]用4种不同试剂处理春小麦，结果表明，C试剂（DMSO＋对氯苯氧乙酸＋COL＋肌醇＋IAA＋2，4-D＋KT）效果最好。孙耀中等[49]对诱导方法进行了研究，结果认为，较为理想的方法是小穗剪颖2/3后，每天19：00将药液注射到颖花内，并套袋。化学诱导法产生单倍体具有操作简单、诱导率高、成本低等优点。

2 展望

目前，对于小麦单倍体育种的研究已非常深入，在小麦单倍体诱导技术中，花药培养和玉米花粉诱导（染色体消失法）是最成熟的两大技术。但是，如何进一步增加单倍体诱导率、减少白化苗的产生仍是难点。另外，将小麦单倍体育种技术结合用于其他育种途径，在遗传育种中有广阔的前景。如与诱变育种相结合，可避免显隐性的干扰，使隐性突变个体当代能显现出来。此外，可利用单倍体产生纯合的二倍体以代替自交系，创造雄性不育系，产生非整倍体、附加系、替换系等。也可在花药培养过程中加入毒素等进行抗病、抗逆、耐盐碱等品种的筛选。在未来的研究中，应进一步提高单倍体的诱导率，并与常规育种等更好地结合，这样单倍体育种在作物品种改良上的作用将更加显著。

［1］陈新民，陈孝.小麦×玉米产生单倍体及双单倍体研究进展[J].麦类作物，1998，18（3）：1-4.

［2］张正.农作物单倍体育种研究概况与思考[J].山东农业科学，2007（5）：122-125.

［3］王茂良，冯慧.花药离体培养研究进展[J].北京农学院学报，2010，25（3）：70-74.

［4］张再君，张超美，张杏芝，等.两种培养基对小麦花培愈伤组织的影响[J].湖北农学院学报，1995，15（4）：269-272.

［5］宋运贤，周素英，杜雪玲，等.小麦花药培养效率的影响因素研究[J].西北农林科技大学学报，2012，40（5）：62-68.

［6］李新华.花药组织培养和小麦×玉米杂交技术应用于产生小麦单倍体的比较研究[J].核农学报，2005，19（1）：13-16.

［7］白延红.花药培养和染色体有选择的消除技术建立小麦DH群体的研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2006.

［8］Saidi N，Cherkaoui S，Chlyah A.Embryo form action and regeneration in Triticum turgidum ssp.durum anther culture[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1997，51（1）：27-33.

［9］蔡正云，吕学莲，白海波，等.基因型对小麦花药培养的影响研究[J].广东农业科学，2014（24）：1-5.

［10］庄军平.辣椒花药培养技术的研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2001.

［11］宣朴，郭元林，岳春芳，等.低温对小麦花培愈伤组织绿苗分化率的影响[J].西南农业学报，2004，17（2）：146-148.

［12］董艳辉，于宇凤，赵兴华，等.小麦单倍体诱导技术及其应用[J].山西农业科学，2014，42（7）：764-767.

［13］马强，余国东，李伯群，等.小麦单倍体诱导技术研究进展[J].南方农业，2010（11）：72-76.

［14］Gustafson D P，Stephen Baenziger.Isolated wheat microspore culture[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture，1995，42：207-213.

［15］Mejza S J，Morgant V.Plant regeneration from isolated microspores of Triticum aestivum[J].Plant Cell Report，1993，12：149-153.

［16］Scott P，Lyne P L.The effect of different carbohydrate sources upon the initiation of embryogenesis from barley microspores[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture，1994，36：129-133.

［17］朱宏，张忠恒.小麦花粉培养中蔗糖浓度外源激素低温前处理对启动细胞分裂的作用[J].哈尔滨师范大学自然科学学报，2002，18（3）：91-95.

［18］Tianci Hu，王辉.小麦花粉培养单倍体加倍后的表现[J].麦类作物学报，1998，18（4）：21-25.

［19］潘家驹.作物育种学总论[M].北京：农业出版社，1994.

［20］刘洪梅，王和乐.小麦孤雌生殖的诱导及其在遗传育种上的应用[J].河南农业科学，2008（3）：8-11.

［21］祝仲纯，吴海珊.从未授粉的小麦及烟草子房培养出单倍体植株[J].遗传学报，1979，6（2）：181-183.

［22］祝仲纯，吴海珊，乔跃民.小麦未传粉子房培养及其单倍体植株无性系的保存与繁殖[J].遗传，1989，11（1）：44.

［23］张素芳，张召铎，刘植义，等.从小麦雄性不育系的未授粉子房诱导单倍体植株[J].遗传，1993，15（1）：20-23.

［24］马强，余国东，李伯群，等.小麦单倍体诱导技术研究进展[J].南方农业，2010（11）：72-76.

［25］胡启德，何宗宇，曹化林，等.诱导小麦孤雌生殖及其应用[J].遗传学报，1979，6（1）：20.

［26］李德炎.小麦育种学[M].北京：科学出版社，1976.

［27］贾静鸾，胡启德，袁淑安，等.远缘花粉延迟授粉诱导小麦单性生殖的染色体观察[J].遗传，1992，14（6）：26-27.

［28］杜连恩，罗景兰.诱导小麦孤雌生殖及其在育种上的应用[J].农业现代化研究，1984（4）：33-36.

［29］赵世绪，朱媚，李春兰，等.用照射花粉授粉在黑麦上获得单倍体[J].北京农业大学学报，1981，7（3）：109-111.

［30］刘娜，赵昌平.小麦孤雌生殖育种技术研究新进展[J].种子，2007，26（3）：47-50.

［31］Barclay I R.High frequencies of haploid production in wheat（Triticum aestivum）by chromosome elimination[J].Nature，1975，256：410-411.

［32］Zenkteler M，Nitzsche W.Wide hybridization experiments in cerea [J].Theor Appl Genet，1984，68：311-315.

［33］Laurie D A.Wheat×maize hybridization[J].Genet Cytol，1986，28：313-316.

［34］Laurie D A，Bennett M D.Cytological evidence for fertilization in haploid wheat×sorghum crosses[J].Plant Breeding，1988，10：73-82.

［35］Ahmad F，Comeau A.Wheat×pearl millet hybridization：consequence and potential[J].Euphytica，1990，50：181-190.

［36］Ushiyama T，Shimizu T，Kuwabara T.High frequency of haploid production of wheat through intergeneric cross with teosinte[J]. Japan J Breeding，1991，41：353-357.

［37］孙敬三，刘辉，路铁刚，等.利用小麦×玉米获得小麦单倍体[J].植物学报，1992，34（11）：817-821.

［38］李大玮，欧阳平，邱纪文，等.染色体消失法在小麦育种中应用的研究[J].农业生物技术学报，2000，8（1）：17-21.

［39］陈新民.提高小麦×玉米产生单倍体频率的研究[C]//第六届全国作物育种讨论会论文集.北京：中国农业科学院，1997.

［40］赵翠荣，杨青，王立峰，等.培养基和基因型对小麦×玉米诱导单倍体效率的影响[J].中国种业，2014（9）：33-35.

［41］吕国锋，范金萍，张伯桥，等.小麦×玉米小麦单倍体胚产生频率的研究[J].江苏农业科学，2002（5）：9-11.

［42］杨雪，夏铁骑，刘春雷，等.小麦花药培养过程中污染问题的分析与控制[J].园艺与种苗，2013（6）：1-3，29.

［43］Kihara H.Substitution of nucleus and its effects on genome manifestation[J].Cytologia，1951，16：177-193.

［44］孙善英.K型小麦雄性不育系诱导单倍体胚的胚胎学观察[J].西北农业大学学报，1993，21（4）：18-25.

［45］张改生.小麦新型易恢复不育细胞质源的建拓与研究[D].南京：南京农业大学，1993.

［46］孙善英，杨天章，刘晚苟.K型小麦细胞质雄性不育系助细胞无配子生殖的细胞学研究[J].西北农业大学学报，1994，22（l）：29-34.

［47］刘洪梅，张改生，刘宏伟，等.小麦孤雌生殖研究进展[J].陕西农业科学，2002（10）：16-18，23.

［48］王金玲，魏凌基，周洪华，等.化学药剂诱导孤雌生殖在春小麦育种中的应用研究[J].新疆农业科学，2005，42（1）：38-40.

［49］孙耀中，董洪平，秦素平，等.化学诱导矮败小麦孤雌生殖育种的研究与应用[J].河南农业科学，2004（3）：3-6.

Methods and Advances of Wheat Haploid Breeding

CUI Ting1，LI Ya-li2，QIAO Lin-yi3，GUO Hui-juan3，DONG Yan-hui2，REN Yong-kang3，TANG Zhao-hui2
（1.College of Bioengineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Research Center of Biotechnology，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；3.Institute of Crop Sciences，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

Haploid breeding technology has provided important technical support for wheat breeding.It is advantageous to shorten the breeding period,speed up breeding process,improve selection efficiency,and has important significance for genetic research.The method of haploid breeding in wheat mainly has isolated culture,pollen induction,chemical induction,induction of heterologous cytoplasm,and soon.In this paper,the influence factors and research progress of these methods are described.

wheat;isolated culture;pollen induction;chemical induction;heterologous cytoplasm induction

S512.1

A

1002-2481（2016）01-0106-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.01.28

2015-10-10

山西省科技攻关项目（20130311001-8）；山西省农业科学院博士基金项目（YBSJJ1413）

崔婷（1991-），女，山西襄垣人，在读硕士，研究方向：小麦遗传育种。唐朝晖为通信作者。