GPI-B7-1锚定肾癌细胞膜对细胞毒性T淋巴细胞杀伤自身肿瘤的促进作用

葛蕙心，张一兵，李慧忠，畅继武

(1贵州省肿瘤医院·贵州医科大学附属医院，贵阳550003；2华北煤炭医学院；3徐州医学院附属医院；4天津医科大学第二附属医院)



GPI-B7-1锚定肾癌细胞膜对细胞毒性T淋巴细胞杀伤自身肿瘤的促进作用

葛蕙心1，张一兵2，李慧忠3，畅继武4

(1贵州省肿瘤医院·贵州医科大学附属医院，贵阳550003；2华北煤炭医学院；3徐州医学院附属医院；4天津医科大学第二附属医院)

目的探讨糖基磷脂酰肌醇(GPI)-B7-1锚定肾细胞癌(RCC)细胞膜能否提高细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对自身肿瘤的杀伤能力。方法 取出本实验室冻存于液氮罐中的经转基因高表达GPI-B7-1 的CHO/DHFR-细胞，再从该CHO/DHFR-细胞上洗脱目的蛋白GPI-B7-1，并进行分离纯化，Western blotting法检测活性。建立肾癌细胞系CG-6327。将CTL分别与GPI-B7-1-CG-6327细胞膜、CG-6327细胞膜、GPI-B7-1-CHO/DHFR-细胞膜作用24 h，此时得到被三种不同物质活化的CTL细胞，再设单纯体外培养的CTL作为对照，分别将上述四种CTL细胞加入到已接种有CG-6327细胞的96孔板中，进行24 h杀伤试验,MTT法测定CTL的杀伤活性。结果 经GPI-B7-1-CG-6327细胞膜活化的CTL细胞杀伤活性(A值)与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，其他几种物质活化的CTL细胞杀伤活性与对照组比较，P均>0.05。结论 通过基因重组方法表达的GPI-B7-1锚定蛋白可被转移并锚定在RCC细胞膜表面提供第二刺激信号，GPI-B7-1锚定后的具有双刺激信号的RCC细胞膜对于CTL的活化有增强作用。

肾肿瘤；糖基磷脂酰肌醇-B7-1；细胞毒性T淋巴细胞；肿瘤免疫

肾细胞癌(RCC)是泌尿系统中第二常见恶性肿瘤，占成人全部恶性肿瘤的2%～3%，占肾脏原发性恶性肿瘤的85%～90%，20%初诊时已转移，30%术后发生转移[1]，且其发病率以每年2%的增长率升高[2]。RCC是免疫原性很强的肿瘤,免疫过程主要是由T淋巴细胞介导[3]，而T淋巴细胞的活化需要两个信号系统，第一信号是由T淋巴细胞受体(TCR)与抗原肽-MHC复合物相结合所提供；第二信号是由共刺激分子或辅助分子通过与T细胞上相应受体结合而传递[4]。RCC缺乏共刺激信号的表达，使T淋巴细胞进入无反应状态或程序性死亡，出现RCC的免疫逃逸。因此,RCC术后的患者迫切需要有效的全身治疗。RCC对放疗、化疗及激素治疗不敏感,单用或联合应用的应答率都不足10%。已经发现和证实许多免疫分子在RCC的治疗中有一定的发展前景。随着细胞表面工程学的发展,GPI-B7-1蛋白可锚定于肿瘤细胞表面,从而提供共刺激信号,加强机体对肿瘤的免疫杀伤[5]。2007年1月～2009年7月，本实验中我们利用前期本实验室构建成功的转基因高表达GPI-B7-1的CHO/DHFR-细胞提取GPI-B7-1，将其再次锚定于自身RCC细胞膜上，从而活化自身T淋巴细胞，观察细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤自身肿瘤的作用。

1　材料与方法

1.1材料细胞系：细胞二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型转基因中国仓鼠卵巢细胞(CHO/DHFR-)高表达GPI-B7细胞株及非转染的CHO/DHFR-细胞系、RCC细胞系CG-6327由本实验室提供。试剂：RPMI-1640、DMEM、MTX、HEPES购自GIBCO公司，胎牛血清购自天津市北晨盛达生物制品厂，G418购自Solarbio公司，FITC标记的鼠抗人CD80单克隆抗体购自CALTAG公司，FITC标记的小鼠抗人IgG、MTT购自SIGMA公司，淋巴细胞分离液、IL-2、IL-4、GM-CSF、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、二甲基亚砜、EDTA、L-谷氨酰胺等均购自国内生化试剂公司，PMSF、TritonX-100均购自于SIGMA公司，低分子蛋白MARKER购自Amersham公司，Tris碱、甘氨酸、聚丙烯酰胺，N,N-亚甲双丙烯酰胺、SDS、TEMED、硫酸铵均购自北京鼎国公司，考马斯亮蓝、溴酚蓝购自SIGMA公司。

1.2GPI-B7-1在CHO/DHFR-细胞表达的观察将冻存于液氮罐中的经转基因高表达GPI-B7-1的CHO/DHFR-细胞取出，用90% DMEM、10%胎牛血清、600 μg/mL G418的完全培养液进行培养，待细胞生长良好后，逐渐向完全培养液中加入MTX，加压培养，促使GPI-B7-1持续高表达。大量扩增细胞,待细胞长出单层，用无血清培养液洗涤2次后悬浮细胞为1×106/mL，取FITC标记的CD80单抗5 μL加入标记好的细胞管中，4 ℃湿盒中温育30 min，0.01%叠氮钠-PBS洗涤3次，点片，加盖玻片，荧光显微镜下观察GPI-B7-1在细胞表面的表达。

1.3GPI-B7的洗脱、鉴定及提取 大量培养扩增转染后的CHO/DHFR-细胞，用PBS洗涤1次，20 mmol/L EDTA-PBS室温下作用30 min，低速离心收集细胞。细胞在裂解缓冲液(5 mmol/L Tris pH 7.0,2 mmol/L MgCL,0.1 mmol/L EDTA,1 mmol/L PMSF,2 μg/mL Aprotinnin,2 μg/mL Leupeptin,1 μg/mL pepstainA) 4 ℃振摇1 h。11 000 g 4 ℃离心20 min可沉降膜。用裂解缓冲液洗涤1次，然后溶于提取缓冲液(1% Triton X-100，10 mmol/L Tris pH 7.4，5 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF,2 μg/mL Aprotinin,2 μg/mL Leupeptin,1 μg/mL pepstainA)4 ℃振摇1 h。11 000 g 4 ℃离心20 min可去除膜成分，留取上清液。用饱和硫酸铵沉淀法沉淀蛋白，静置1.5 h时，在PBS中4 ℃透析24 h。用蛋白浓缩柱浓缩蛋白。GPI-B7-1蛋白经去离子去污剂洗脱后,用PBS透析24 h，SDS-PAGE电泳，经电转，蛋白条带完全转移到醋酸纤维膜上，进行Western blotting检测，在66 kD附近有一条浅褐色条带。证明可以得到较纯的GPI-B7-1，其量>10 μg/mL。

1.4 RCC细胞的培养及建系 取天津医科大学第二附属医院1例男性RCC手术患者的肾癌组织一块,大小约1 cm×1 cm，直接组织块法进行原代培养。培养5～7 d后可见组织块周围有细胞爬出，培养2～4周可形成单层细胞，细胞呈梭形，折光性好，胞质丰富，胞核大可见核仁。予以传代和冻存,细胞爬片，行HE染色鉴定及透射电镜下观察,细胞呈圆形，表面可见微绒毛，核偏位，不规则，为常染色质，未见核仁。胞质内可见大量有膜包围的空泡，空泡内为微管、髓样结构及不定形物。近细胞边缘处的胞质内可见线粒体、微管、微丝及核蛋白体，说明细胞增殖良好，可用于传代。传代培养，F1大量冻存，以后间隔数代冻存1次，进行细胞系鉴定和指标检测，建立RCC细胞系，命名为CG-6327。

1.5 淋巴细胞分离、培养 取上述该患者5 mL静脉血，无菌条件下放入装有肝素的培养瓶中，带入超净台，进行淋巴细胞分离。取10 mL离心管加入淋巴细胞分离液4.5 mL，再加入静脉血5 mL，2 500 r/min离心15 min。轻轻吸取白色云雾状淋巴细胞层，移入一装有DMEM培养液5 mL的离心管中。1 500 r/min离心15 min。离心后弃上清，管底可见白色沉淀，将沉淀悬于含有IL-2、IL-4、GMCSF的DMED培养液中，移入50 mL培养瓶中进行培养。

1.6不同RCC细胞膜作用下的CTL杀伤能力检测取CG-6327细胞作为靶细胞，以每孔1×104个细胞接种96孔板，将分别经过GPI-B7-1-CG-6327细胞膜、CG-6327细胞膜、GPI-B7-1-CHO/DHFR-细胞膜作用的CTL及未处理的CTL分别按CTL∶CG-6327为10∶1的效靶比加入96孔板中，每组设12个复孔，不加CTL的CG-6327作为对照，进行24 h杀伤试验。作用24 h后，换液，每孔加入RPMI1640基础培养基100 μL，用MTT法测定CG-6327的活性。

2　结果

2.1GPI-B7-1融合基因的表达产物鉴定经基因转染后的GPI-B7-1 CHO/DHFR-细胞生长状态良好，FITC标记的CD80直接免疫荧光检测结果显示，GPI-B7-1 CHO/DHFR-细胞表现出强黄绿色荧光。荧光强度为35.2。

2.2GPI-B7-1的鉴定结果通过Western blotting鉴定，在66 kD附近有一条浅褐色条带，证明为GPI-B7-1，其量>10 μg/mL。

2.3GPI-B7-1-RCC细胞膜活化CTL对自身肿瘤细胞的杀伤作用经GPI-B7-1-CG-6327、CG-6327、GPI-B7-1-CHO/DHFR-细胞膜活化的CTL作用下，CG-6327细胞的A值分别为0.308、0.390、0.376，仅行体外培养的CTL作用下，CG-6327细胞A值为0.358。未加入CTL的CG-6327细胞A值0.516。不同细胞膜活化的CTL作用下，CG-6327细胞的A值比较，F=3.647，P<0.05。GPI-B7-1-CG-6327细胞膜活化的CTL杀伤CG-6327细胞活性与对照比较，P<0.05，其他细胞膜比较，P均>0.05。

3　讨论

T淋巴细胞是机体介导肿瘤免疫应答的细胞,其活化需要双信号，即由TCR介导的抗原特异性第一信号和由共刺激因子介导的非抗原特异性的第二信号。缺乏共刺激信号可以导致T细胞的免疫耐受或引起活化T细胞程序性死亡[6]。正常的免疫应答反应取决于B7-1-CD28介导的T细胞活化和B7-1-CTLA-4介导的抑制性信号之间的平衡[7]。B7-1是介导肿瘤免疫反应的一种重要的共刺激因子，因此，本实验选用B7-1作为研究对象。

由于肿瘤细胞表面不能正常表达B7-1共刺激分子，导致经抗原识别初始活化的CTL细胞不能进入完全活化状态，因而不能产生对肿瘤细胞有免疫攻击作用的细胞因子；不能诱导产生对肿瘤细胞行膜裂解的信号，进行有效免疫攻击[8]。GPI锚定蛋白转化法为一种新型肿瘤细胞疫苗研制的方法。其优点在于：①许多原始细胞无论正常细胞或是肿瘤细胞均不易于在体外长期生长，且难以稳定转染；而蛋白转化法则不依赖于细胞增殖潜能及可转染性，故可用于较难转染的细胞，与细胞类型无关。②在同一细胞中复合基因的共转染和协同表达在许多方面还困难重重，但蛋白转化本质上可允许无限数量的蛋白同时传递或顺序整和入同一细胞。③与基因转化不同，蛋白转化是一个非常迅速的过程，更具有可行性，尤其适用于临床治疗。④GPI蛋白转化法不仅用于体外细胞修饰，还可以用于组织内原位细胞修饰[9]。人们已成功地将多种目标蛋白如PIM-1分子、CXCL10趋化因子、IL-2进行GPI转化，证实了此法的可行性[10]。

RCC是一种免疫原性肿瘤，能通过多种机制逃避机体的免疫监视，这也是目前免疫治疗效果不理想的主要原因[11]。国外研究发现，对RCC患者进行免疫治疗中，大多数RCC患者都能从中获益[12]。利用B7-1基因修饰的RCC细胞作为转移性RCC的肿瘤疫苗已取得了一定的疗效[13]。Anto等[14]将15例份肿瘤组织分别在组织培养基中进行培养，并导入B7-1基因，然后以接种疫苗的方式进行皮下注射，全身应用IL-2以增强由疫苗激活的T细胞增殖对转移性RCC患者进行了一期临床试验，9例有反应，2例部分缓解，2例稳定，未见明显过敏反应及不良反应。本研究结果显示，GPI-B7-1-CG-6327细胞膜活化的CTL杀伤CG-6327细胞活性明显强于未进行细胞膜锚定的细胞。提示通过GPI蛋白转化法将B7-1共刺激信号锚定于RCC细胞膜上，确实可以弥补RCC细胞膜表面不表达B7-1的缺陷，从而提高了CTL对RCC的杀伤。我们使用肿瘤细胞膜进行锚定，一方面克服活瘤细胞可能的不良作用；另一方面细胞膜不再分裂，没有代谢功能，这样给GPI锚定分子一个稳定环境，使得整合到膜上的GPI蛋白较细胞上的蛋白具有更大的稳定性；且细胞膜在冷冻(-70 ℃)条件下可长期保存，又可从新鲜冰冻的瘤组织中提取细胞膜，使得从外科手术分离的肿瘤组织中分离细胞膜进行锚定成为可能[15]。

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Glycosyl-phosphatidylinositol-B7-1 anchoring into renal carcinoma cell membranes enhances CTL's ability of killing carcinoma cells

GEHuixin1,ZHANGYibing,LIHuizhong,CHANGJiwu

(1GuizhouCancerHospital,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guizhou550003,China)

ObjectiveTo investigate whether GPI-B7-1 anchoring into the renal carcinoma cell membrane can improve the cytotoxic T lymphocyte (CTL)'s ability of killing the cancer cells. MethodsWe selected the CHO/DHFR-cells that were genetically modified to highly express GPI-B7-1 in liquid nitrogen tanks, then, the target protein GPI-B7-1 was eluted from the CHO/DHFR-cells and purified. The activity was detected by Western blotting. The renal cell carcinoma cell line CG-6327 was established. We cultured the autologous CTL admixed with GPI-B7-1-CG-6327 membrane, CG-6327 membrane and GPI-B7-1-CHO/DHFR-membrane for 24 hours, and up to now, we got three kinds of CTL. Simple CTL cultured in vitro was taken as the control group, then these four kinds of CTL were added into 96-well plates which were inoculated with CG-6327 cells for the 24-hour killing experiment. The killing activity of CTL was detected by MTT.Results The killing activity (A value) of GPI-B7-1-CG-6327 cell membrane-activated CTL was statistically different as compared with that of the control group (P<0.05). No significant difference was found in the CTL cell killing activity activated by others as compared with that of the control group, allP>0.05.Conclusion GPI-B7-1 anchored protein can be transferred and anchored in the cell membrane of RCC surface which provides a second stimulus, and RCC cell membrane with double stimulation signal anchored by GPI-B7-1 has a greater effect for the activation of CTL.

kidney neoplasms; GPI-B7-1; cytotoxic T lymphocyte; tumor immunity

天津市科委重点科研资助项目(043114211)。

葛蕙心(1978-)，女，副主任医师，硕士，主要从事泌尿系统肿瘤免疫治疗方面的研究。E-mail:34865852@qq.com

简介：畅继武(1938-)，男，博士生导师，国务院特聘专家，国际泌尿外科学会会员，主要研究方向为肿瘤免疫及病理学。E-mail:changjiwu2004@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.29.003

R737.11

A

1002-266X(2016)29-0007-04

2016-01-08)