药物诱导自噬对慢性髓系白血病细胞的作用及其机制研究进展

刘慧敏，陈亦雨，贺艳杰，李玉华

(南方医科大学珠江医院，广州510280)

药物诱导自噬对慢性髓系白血病细胞的作用及其机制研究进展

刘慧敏，陈亦雨，贺艳杰，李玉华

(南方医科大学珠江医院，广州510280)

慢性髓系白血病(CML)是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性肿瘤，其药物治疗常伴随自噬激活。一方面自噬可以对白血病细胞产生保护作用，维持细胞生存；另一方面自噬可以诱导白血病细胞的凋亡。合理联合应用自噬调节剂对CML的治疗可能会有益。

自噬；慢性髓系白血病；药物疗法；自噬调节剂

慢性髓系白血病(CML)是以9号染色体与22号染色体异位生成断裂点簇区/阿伯尔森1(BCR-ABL1)基因为特征的一种造血干细胞恶性克隆性疾病，约占成人新诊断白血病的15%。靶向药物酪氨酸激酶抑制剂(TKI)伊马替尼(IM)的问世是CML治疗史上的里程碑，使CML成为药物可控的慢性疾病，但仍有近20%的CML经IM治疗无法达到完全缓解，而且加速期和急变期患者对IM耐药已成为临床上的普遍现象。IM耐药机制复杂，包括BCR-ABL1基因激酶域或非激酶域点突变、BCR-ABL1基扩增及药物泵高表达等[1]。第二代TKI尼洛替尼和达沙替尼可克服部分耐药现象，但对T315I(位于BCR-ABL1基因激酶域)突变的CML患者无效。第三代TKI帕那替尼克服了T315I突变导致的耐药，但不良反应严重。自噬是发生在真核细胞中的一种保守机制，基础水平的自噬可维持细胞稳态和能量平衡。在饥饿、缺氧、药物刺激、放射、病原体入侵等不利条件下，自噬被高度激活，一方面通过降解受损细胞器和错误折叠的蛋白减轻炎症反应导致的进一步损伤，另一方面可将氨基酸、脂肪酸等降解产物供细胞循环利用，帮助细胞克服应激[2]。自噬对CML细胞的生存具有两面性：一方面产生保护性作用，维持白血病细胞存活；另一方面可以促进白血病细胞凋亡。现将药物诱导自噬对CML的作用及机制、自噬调节剂的作用机制等相关研究进展情况综述如下。

1 自噬与肿瘤

自噬在肿瘤的发生发展中有双重作用[3]。肿瘤多发生在器官或组织受损的基础上。自噬能帮助细胞清除有害物质，维持基因组稳定性。但如果自噬缺陷则增加基因错误修复发生率，削弱细胞和机体对抗应激的能力，促进肿瘤发生。肿瘤完全形成后，自噬将发挥促进肿瘤进一步恶化的作用，原因在于肿瘤细胞的过速增殖伴随大量正常细胞的死亡和干细胞的激活，并导致局部缺血缺氧，此时肿瘤细胞依靠自噬缓解高代谢压力，抵抗不良环境，继而存活。

2 药物诱导自噬对CML细胞的作用及其机制

自噬在肿瘤治疗中的作用同样也有双面性。诸多化疗药物可诱导自噬，这可能与药物导致的细胞应激有关。一方面药物诱导自噬可能是肿瘤的自我保护机制，另一方面药物可诱导肿瘤细胞发生自噬性死亡。药物诱导自噬在促进细胞生存或死亡这两者之间的选择和转换可能与细胞类型、肿瘤分期、基因背景以及肿瘤微环境有关。

2．1 药物诱导自噬对CML细胞的保护作用及其机制 多种药物可诱导CML细胞发生保护性自噬，包括TKI和非TKI。

2.1.1 TKI诱导自噬对CML细胞的保护作用及其机制 TKI可激活自噬，并对CML细胞起保护作用。Mishima等[4]研究发现，IM诱导CML来源的K562细胞发生自噬，抑制自噬后不仅增强IM对野生型BCR-ABL1基因细胞的毒性效应，而且促进BCR-ABL1基因T315I突变的细胞死亡，该研究提示抑制自噬可克服顽固诸如T315I点突变导致的IM耐药。

CML干细胞对IM不敏感，使得残留的干细胞在停药后快速增殖，这是CML复发的根本原因。Crowley等[5]研究发现，IM停药后CML细胞的活力恢复伴随高水平自噬，抑制自噬可逆转这一现象。此外有研究[6]发现，自噬相关基因ATG4B在耐药的白血病干/祖细胞中高表达，敲除ATG4B基因可以抑制自噬，使CML干细胞对IM的敏感性增加。以上研究结果提示抑制自噬有可能成为消除CML微小残留病灶的新策略。

IM如何诱导自噬？自噬又如何促进CML细胞存活？其机制仍未完全阐明。Sheng等[7]认为内源性BCR-ABL1基因可持续激活Akt/mTOR通路并负性调节自噬，而IM可能通过抑制BCR-ABL1/PI3K/AKT/FOXO4/ATF5/mTOR通路诱导自噬。Bellodi等[8]研究发现，IM诱导自噬与内质网应激以及钙流动态平衡有关。Mancini等[9]也得到了类似的结论，并发现β-catenin 75 kDa剪接体参与IM诱导自噬的过程。笔者所在课题组前期研究发现IM诱导小鼠CML细胞32D-p210T315I和S4C2-1自噬流水平升高，且其mTOR及其下游分子p-4EBP1和p-70S6K表达减少，提示该自噬过程可能依赖mTOR表达。以上研究结果表明IM可通过自噬导致CML细胞耐药，采用IM联合自噬抑制剂的治疗方案有望增强疗效。

随着第二、三代TKI的广泛应用，对自噬的研究扩展到IM以外的其他靶向治疗药物。Bafetinib是一种BCR-ABL1/Lyn双重抑制剂，可强烈诱导保护性自噬[10]。新型酪氨酸激酶抑制剂Thiotanib使CML细胞自噬水平升高，可能与Thiotanib抑制AKT/mTOR通路、激活Erk、促进Beclin 1与Bcl-2解耦联，形成自噬核心复合体Beclin1/Vps34等机制有关[11]。这些研究结果证实TKI可诱导保护性自噬，而抑制自噬有可能增强TKI的疗效，促进CML细胞死亡。

2.1.2 非TKI诱导自噬对CML细胞的保护作用及及其机制 非TKI也可诱导保护性自噬。α干扰素(IFNα)是前TKI时代广泛用于CML治疗的药物，近年来由于TKI疗效不足的显现，IFNα又重新引起学者关注。IFNα通过JAK1-STAT1和RELA通路激活Beclin1，诱导自噬，而抑制自噬可激活Caspase8-Bid通路，增强IFNα的促凋亡作用[12]。

组蛋白乙酰化水平异常在白血病的发生发展中至关重要，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(SAHA)可通过周期阻滞、凋亡诱导、新生血管抑制等机制发挥其抗肿瘤活性。Carew等[13]研究发现，SAHA使CML细胞的自噬水平显著升高，抑制自噬通过促进溶酶体蛋白酶D向胞质转移而增强SAHA的促凋亡作用。

白血病细胞耐药与Hedgehog(Hh)通路持续活化有关。Zeng等[14]发现抑制Hh通路也可诱导CML细胞发生自噬，联用自噬抑制剂可显著降低耐药细胞的活性，并降低BCR-ABL1蛋白表达水平，对正常的外周血单个核细胞杀伤作用小。

2.2 药物诱导自噬对CML细胞自噬性死亡的作用及其机制 适当程度的自噬可以帮助细胞应对不良条件，度过危机，但过度激活自噬将耗竭细胞内的物质和能量，即发生“自食”现象，促进细胞走向衰亡。Elzinga等[15]认为IM诱导自噬形成的自噬体可隔离BCR-ABL1蛋白，并进一步将其降解。Goussetis等[16]发现三氧化二砷可以通过自噬功能蛋白p62/SQSTM1将BCR-ABL1蛋白锚定于自噬溶酶体，再通过组织蛋白酶cathepsin B将其降解，抑制自噬或阻止BCR-ABL1蛋白的降解。以上研究提示药物可能通过诱导自噬降解BCR-ABL1蛋白，抑制细胞活性。

活性氧簇(ROS)是细胞代谢产生的强反应活性分子，也是诱导细胞自噬发生的重要原因。研究[17]发现，脂肪酸衍生物AIC-47通过PPAR/Catenin/BCR-ABL/mTOR/hnRNP/PKM通路使ROS生成增多，进一步导致CML细胞发生自噬性死亡。

多种草本植物提取物都有良好的抗肿瘤效果，其对CML的作用也受到广泛关注，如白藜芦醇通过激活JNK通路使p62/SQSTM1蛋白聚集，同时上调AMPK表达，抑制mTOR通路，解除mTOR对自噬的抑制作用，从而诱导细胞走向自噬性死亡[18]。

近年来溶瘤腺病毒在肿瘤中的应用研究成为热点，其作用机制在于激活肿瘤细胞的凋亡通路。Tong等[19]构建了过表达自噬基因Beclin 1的重组溶瘤腺病毒SG511-BECN，该病毒对正常细胞毒性极小，但可以强烈诱导CML原始细胞死亡，而干扰自噬基因UVRAG、ATG5和ATG7。该研究揭示了自噬在溶瘤腺病毒治疗中的作用。

3 自噬调节剂的作用机制

3.1 自噬抑制剂 化疗药物联合自噬抑制剂的治疗方案可增加肿瘤对化疗药物的敏感性。不同的自噬抑制剂的作用机制不同，主要有以下三方面：①抑制溶酶体功能：自噬底物降解需要溶酶体水解酶的参与，溶酶体烷化剂氯喹和羟氯喹可通过中和溶酶体囊泡的酸性而抑制该过程。氯喹衍生物Lys05和Monensin有更强的亲溶酶体性，可发挥更加显著的自噬抑制作用[20]。目前羟氯喹联合IM治疗CML的Ⅱ期临床试验正在进行中，有望成为CML治疗的重大突破。②调节PI3K活性：哺乳动物有三型PI3K。ClassⅠPI3K促进mTOR活化，抑制自噬；Class Ⅲ PI3K是酵母细胞中液泡分选蛋白 34(Vps34)在哺乳动物中的同源物，其与酵母自噬基因Beclin1、Vps15/p150、 ATG14L以及抗紫外线相关基因等形成自噬核心复合物，正性调节自噬。LY294002、渥曼青霉素、3-甲基腺嘌呤(3-MA)可同时抑制ClassⅠPI3K和Class Ⅲ PI3K，但通常对Class Ⅲ PI3K的抑制作用更强，故其作为自噬抑制剂被广泛应用。然而，近年来有研究[21]发现10 mmol/L的3-MA在体外可有效抑制自噬体形成，但相同剂量的3-MA在体内却促进自噬的发生，原因可能是3-MA在体内对ClassⅠPI3K的抑制作用更强。小分子化合物Spautin-1是一种新型强效自噬抑制剂，可通过靶向泛素特异性蛋白酶USP10和USP13促进Beclin1和Vps34降解，进而抑制自噬。Shao等[22]发现Spautin-1可逆转CML细胞对IM的耐药。此外，Mill等[23]设计了一系列靶向Vps34的化合物，如PT21等，将有望作为特异性自噬抑制剂得到应用。③调节细胞内钙水平：钙离子是细胞信号转导过程中的第二信使，参与多种信号通路调控，在自噬发生过程中也有不可或缺的作用。Ganley等[24]发现毒胡萝卜内酯可通过干扰钙离子稳态抑制自噬。

3.2 自噬激动剂 对于化疗药物诱导的自噬，我们可以通过联用自噬激动剂进一步增强自噬反应，更快更彻底杀灭肿瘤细胞。雷帕霉素通过抑制mTORC1活性，诱导自噬。新型mTOR抑制剂PP242和Torin 1可同时抑制mTORC1和mTORC2而诱导自噬[25]。

Obatoclax是一种BH3域类似物，也参与自噬调控，可能机制是Obatoclax通过抑制Bcl-2和Mcl，解除与Beclin1的耦联作用，促进自噬[26]。Bonapace等[27]发现将Obatoclax与糖皮质激素联用可显著抑制mTOR底物表达，触发耐糖皮质激素的ALL细胞发生自噬性死亡。

综上所述，在CML治疗过程中，多种药物可诱导CML细胞发生自噬，但相应的生物学效应却不尽相同，既有可能促进CML细胞存活，也有可能加速CML细胞死亡。这一现象与自噬水平高低、自噬所处时期、CML的发展阶段、CML细胞所处的微环境、药物种类及作用机制等息息相关。深入探索现有药物对自噬的调节作用，同时开发特异性的小分子自噬调节药物，将其与化疗联合应用，抑制保护性自噬或诱导自噬性死亡，将有望为CML的治疗带来新的契机。

[1] Huang R, Kang Q, Liu H, et al. New insights into the molecular Resistance mechanisms of chronic myeloid leukemia[J]. Curr Cancer Drug Targets, 2016,16(4):323-345.

[2] Filomeni G, De Zio D, Cecconi F. Oxidative stress and autophagy: the clash between damage and metabolic needs[J]. Cell Death Differ, 2015,22(3):377-388.

[3] Cheong H. Integrating autophagy and metabolism in cancer[J]. Arch Pharm Res, 2015,38(3):358-371.

[4] Mishima Y, Terui Y, Mishima Y, et al. Autophagy and autophagic cell death are next targets for elimination of the resistance to tyrosine kinase inhibitors[J]. Cancer Sci, 2008,99(11):2200-2208.

[5] Crowley LC, Elzinga BM, O′Sullivan GC, et al. Autophagy induction by Bcr-Abl-expressing cells facilitates their recovery from a targeted or nontargeted treatment[J]. Am J Hematol, 2011,86(1):38-47.

[6] Rothe K, Lin H, Lin KBL, et al. The core autophagy protein ATG4B is a potential biomarker and therapeutic target in CML stem/progenitor cells[J]. Blood, 2014,123(23):3622-3634.

[7] Sheng Z, Ma L, Sun JE, et al. BCR-ABL suppresses autophagy through ATF5-mediated regulation of mTOR transcription[J]. Blood, 2011,118(10):2840-2848.

[8] Bellodi C, Lidonnici MR, Hamilton A, et al. Targeting autophagy potentiates tyrosine kinase inhibitor-induced cell death in Philadelphia chromosome-positive cells, including primary CML stem cells[J]. J Clin Invest, 2009,119(5):1109-1123.

[9] Mancini M, Leo E, Campi V, et al. A calpain-cleaved fragment of β-catenin promotes BCRABL1+cell survival evoked by autophagy induction in response to imatinib[J]. Cell Signal, 2014,26(8):1690-1697.

[10] Kamitsuji Y, Kuroda J, Kimura S, et al. The Bcr-Abl kinase inhibitor INNO-406 induces autophagy and different modes of cell death execution in Bcr-Abl-positive leukemias[J]. Cell Death Differ, 2008,15(11):1712-1722.

[11] Fan J, Dong X, Zhang W, et al. Tyrosine kinase inhibitor Thiotanib targets Bcr-Abl and induces apoptosis and autophagy in human chronic myeloid leukemia cells[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2014,98(23):9763-9775.

[12] Zhu S, Cao L, Yu Y, et al. Inhibiting autophagy potentiates the anticancer activity of IFN1α/IFNα in chronic myeloid leukemia cells[J]. Autophagy, 2014,9(3):317-327.

[13] Carew JS, Nawrocki ST, Kahue CN, et al. Targeting autophagy augments the anticancer activity of the histone deacetylase inhibitor SAHA to overcome Bcr-Abl-mediated drug resistance[J]. Blood, 2007,110(1):313-322.

[14] Zeng X, Zhao H, Li Y, et al. Targeting Hedgehog signaling pathway and autophagy overcomes drug resistance of BCR-ABL-positive chronic myeloid leukemia[J]. Autophagy, 2015,11(2):355-372.

[15] Elzinga BM, Nyhan MJ, Crowley LC, et al. Induction of autophagy by Imatinib sequesters Bcr-Abl in autophagosomes and down-regulates Bcr-Abl protein[J]. Am J Hematol, 2013,88(6):455-462.

[16] Goussetis DJ, Gounaris E, Wu EJ, et al. Autophagic degradation of the BCR-ABL oncoprotein and generation of antileukemic responses by arsenic trioxide[J]. Blood, 2012,120(17):3555-3562.

[17] Shinohara H, Taniguchi K, Kumazaki M, et al. Anti-cancer fatty-acid derivative induces autophagic cell death through modulation of PKM isoform expression profile mediated by bcr-abl in chronic myeloid leukemia[J]. Cancer Lett, 2015,360(1):28-38.

[18] Puissant A, Robert G, Fenouille N, et al. Resveratrol promotes autophagic cell death in chronic myelogenous leukemia cells via JNK-Mediated p62/SQSTM1 expression and AMPK activation[J]. Cancer Res, 2010,70(3):1042-1052.

[19] Tong Y, You L, Liu H, et al. Potent antitumor activity of oncolytic adenovirus expressing Beclin-1 via induction of autophagic cell death in leukemia[J]. Oncotarget, 2013,4(6):860-874.

[20] Amaravadi RK, Winkler JD. Lys05: a new lysosomal autophagy inhibitor[J]. Autophagy, 2012,8(9):1383-1384.

[21] Wu YT, Tan HL, Shui G, et al. Dual role of 3-methyladenine in modulation of autophagy via different temporal patterns of inhibition on class I and Ⅲ phosphoinositide 3-kinase[J]. J Biol Chem,2010, 285(14):10850-10861.

[22] Shao S, Li S, Qin Y, et al. Spautin-1, a novel autophagy inhibitor, enhances imatinib-induced apoptosis in chronic myeloid leukemia[J]. Int J Oncol, 2014,44(5):1661-1668.

[23] Miller S, Tavshanjian B, Oleksy A, et al. Shaping development of autophagy inhibitors with the structure of the lipid kinase Vps34[J]. Science, 2010,327(5973):1638-1642.

[24] Ganley IG, Wong PM, Gammoh N, et al. Distinct autophagosomal-lysosomal fusion mechanism revealed by thapsigargin-induced autophagy arrest[J]. Mol Cell, 2011,42(6):731-743.

[25] Hsieh AC, Costa M, Zollo O, et al. Genetic dissection of the oncogenic mTOR pathway reveals druggable addiction to translational control via 4EBP-eIF4E[J]. Cancer Cell, 2010,17(3):249-261.

[26] Sharma A, Singh K, Mazumder S, et al. BECN1 and BIM interactions with MCL-1 determine fludarabine resistance in leukemic B cells[J]. Cell Death Dis, 2013,4(5):628.

[27] Bonapace L, Bornhauser BC, Schmitz M, et al. Induction of autophagy-dependent necroptosis is required for childhood acute lymphoblastic leukemia cells to overcome glucocorticoid resistance[J]. J Clin Invest, 2010,120(4):1310-1323.

国家自然科学基资助项目(81372249)；国家自然科学基金青年科学基金资助项目(81300431)。

李玉华(E-mail: liyuhua2011gz@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.036

R733.72；R551.3

A

1002-266X(2016)43-0108-04

2016-07-23)