补肾利湿法对大鼠痛风性关节炎MMP3、Caspase-5表达的影响*

姜德友　冯　涛　陈　飞　韩洁茹　柳成刚　隋方宇

黑龙江中医药大学(哈尔滨150040)



补肾利湿法对大鼠痛风性关节炎MMP3、Caspase-5表达的影响*

姜德友冯涛陈飞韩洁茹柳成刚隋方宇△

黑龙江中医药大学(哈尔滨150040)

摘要目的：建立急性痛风性关节炎(gouty arthritis，GA)大鼠模型，研究炎症因子和抗炎因子的表达情况，明确补肾利湿法防治痛风性关节炎的作用机制，为补肾利湿法防治痛风性关节炎提供理论依据。 方法：将84只SD大鼠随机分为7组：依次为空白组、模型组、中药对照组、西药对照组及中药低、中、高剂量组，每组各12只采用尿酸钠联合氧嗪酸钾诱导实验动物GA模型，应用ELISA法，分别检测各组大鼠血清中MMP3、Caspase-5的含量。 结果：与空白对照组相比，造模各组血液与滑膜组织中MMP3与Caspase-5的水平均显著增高。中药经方中剂量组、高剂量组与模型组相比，血液和滑膜组织中MMP3与Caspase-5的浓度有所增加，与秋水仙碱组无差异。而痛风舒组和经方低剂量组，与模型组相比，血液和滑膜组织中MMP3、Caspase-5的浓度有所下降,但与秋水仙碱组比较仍有差异。但是，痛风舒组和经方低剂量组MMP3、Caspase-5的浓度与模型组相比，差异无统计学意义。 结论：补肾利湿法可抑制大鼠急性痛风性关节炎中MMP3、Caspase-5的表达，对防治GA有一定的作用。

主题词 关节炎，痛风性MMP3Caspase-5@补肾利湿

痛风性关节炎是由于尿酸钠沉积于关节滑膜组织引起的炎症反应，目前仍以西药为主来控制痛风性关节炎的急性发作，如促尿酸排泄剂、抑制尿酸生成剂、秋水仙碱、激素等，但此类药物副作用多，中毒率高，易引发肾功能损害、皮肤过敏甚至毒性上皮坏死[1-2]。因此选择安全有效的中医中药对于防治痛风性关节炎是大势所趋。本实验研究目的在于，通过研究补肾利湿法对防治GA炎的作用机制，为中药治疗GA提供理论依据。

1材料1.1实验动物 选取健康雄性SD大鼠共84只，体重(200±20) g，黑龙江中医药大学实验动物中心提供[SCXK(黑)2008-0017]。

1.2实验仪器多用途高速台式离心机(贝克曼X-22R )，电子分析天平(梅特勒AL204)，酶标仪(Gene Company synergy H7)，恒温鼓风干燥箱(上海一恒DHG-9140A)。

1.3实验药品与试剂补肾利湿法中药处方(泽泻、熟地黄、山茱萸、萆薢等组成，黑龙江中医药大学附属第一医院中药房)。痛风舒片(批号140301)；秋水仙碱(批号140807)；微量尿酸钠结晶(批号CAS1198-77-2)、氧嗪酸钾(批号CAS2207-75-2)。MMP3 Elisa试剂盒(批号201501)、Caspase-5 Elisa试剂盒(批号201501)。

2实验方法2.1补肾利湿法处方中药溶液的制备将每剂处方中药材置入砂锅中，加入4倍体积的水后，浸泡30min后分2次煎煮，煎30min/次,去渣后两煎混合，G4滤器过滤，于60℃水浴中浓缩成含原液3.74g/mL的药液，取部分药液稀释浓度为其浓度0.5倍，另取部分药液浓缩至其浓度2倍，3组药液均密封隔水煮沸消毒，4℃冰箱恒温保存待用。

2.2实验动物分组适应性喂养1周后将大鼠随机分为7组，每组各12只，分别为空白组、模型对照组、痛风舒对照组(0.1g/mL)、秋水仙碱对照组(0.05mg/mL)、中药低剂量组(2g/kg)、中药中剂量组(5g/kg)、中药高剂量组(10g/kg)。 灌胃量根据大鼠体重换算，以1mL/0.1kg为标准剂量，空白组和模型组灌胃生理盐水，其余各组灌胃相应药物。1d1次，连续7d，末次给药后造模。

2.3痛风性关节炎模型的建立用3%氧嗪酸钾溶液，以15mL/kg进行换算，对实验大鼠进行腹腔内注射。15min后将其仰卧固定， 碘伏消毒右后肢小腿膝关节，用BD针在大鼠右后肢膝关节右后侧从35±5°方向插入至肌腱内侧,感觉有落空感后，注人10%尿酸钠溶液0.2mL，制备GA模型。 空白组右后肢膝关节注射等体积生理盐水。

2.4样本采集造模成功后对实验大鼠于眼眶进行取血，室温下静置30min，3500r/min离心15min，分离血清取上清液，置于4℃冰箱冻存待测。

2.5检测指标取血清，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清及滑膜组织中MMP3、Caspase-5的浓度，具体步骤按照试剂盒说明书进行。

2.6统计学方法采用SPSS17.0进行数据分析。所有计量资料用均数±标准差表示。多组样本均数间比较选择单因素方差分析，两组样本间均数间比较采用t检验。P<0.05认为有统计学意义 。

3结果3.1血清中MMP3的表达情况与空白对照组相比，造模各组血液中MMP3的水平明显增高(P<0.05)。补肾利湿法经方中剂量组、高剂量组与模型组相比，血液中MMP3的浓度明显下降(P<0.05)，与秋水仙碱组无差异(P>0.05)。而痛风舒组和经方低剂量组，与模型组相比，血液MMP3的浓度有所下降(P<0.05),但与秋水仙碱组比较仍有差异(P<0.05)。但是，痛风舒组和经方低剂量组MMP3的浓度与模型组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

3.2血清中Caspase-5的表达情况与空白对照组相比，造模各组血液中Caspase-5的水平显著增高(P<0.05)。补肾利湿法经方中剂量组、高剂量组与模型组相比，血液中Caspase-5的浓度明显下降(P<0.05)，与秋水仙碱组无差异(P>0.05)。而痛风舒组和经方低剂量组，与模型组相比，血液中Caspase-5的浓度有所下降(P<0.05),但与秋水仙碱组比较仍有差异(P<0.05)。但是，痛风舒组和经方低剂量组Caspase-5的浓度与模型组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

4讨论研究表明关节组织中尿酸钠(Monosodium urate monohydrate，MSU)结晶沉积是痛风发作的主要诱因，局部粒细胞吞噬尿酸盐结晶会引起关节组织的炎症反应[3]。Caspases家族是近年研究发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，其中Caspases-5，参与白介素前体的活化,是具有一定特异性的炎症标记物，其间接反应痛风性关节炎患者炎症的病情程度[4]。在骨吸收作用中，基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs) 发挥重要作用，其能够降解骨关节中的骨基质，尤其是破骨细胞表达的基质金属蛋白酶 3(Matrix metalloproteinase 3，MMP3) ，研究表明其在骨吸引中起重要作用[5]。Hayami等[6]研究表明，骨质中表达MMP3，其不仅参与骨基质的降解同时导致骨量减少。近几年学者对MMP3的研究也表明，MMP3的水平与痛风性关节炎中骨组织损伤的程度具有一定的相关性。故可认为血清中MMP3、Caspase-5水平可以作为判断急性痛风性关节炎病情程度的重要指标之一。

最早在朱丹溪的 《格致余论·痛风论》中即有“痛风”、“历节风”等论述，并指出血分受热，污浊凝滞是其主要病因病机。而近代医家普遍认为本病多由先天禀赋不足加之后天饮食过于肥甘厚腻，碍脾伤肾。肾气不化，致湿浊内生，蕴聚不解，酿生浊毒。湿浊内盛或湿浊化热，流注关节、筋骨，致经脉闭阻，即可出现关节痹痛；水湿不化，水液内蓄可致水肿等变证；或湿凝为痰，痰瘀互结而变生痛风石。故本研究以补肾利湿法立方，以汉代医家张仲景的肾气丸组方演变而来，方剂由熟地黄、泽泻、山药、山茱萸、萆薢等组成，共奏清热利湿，祛浊补肾之效。宋艳芳[7]研究表明清热利湿，祛浊补肾这一治法对痛风的防治都有积极的影响。我们利用补肾利湿法治疗大鼠急性痛风性关节炎模型，在前期实验中抗炎、消肿及镇痛都显示了良好的效果[8]。补肾利湿法处方中药对于改善GA的炎症症状方面具有积极效应。造模后模型组血清MMP3、Caspase-5表达显著上升，本研究结果表明补肾利湿法处方中药可能通过抑制MMP3、Caspase-5表达，从而实现缓解炎症，减少骨组织破坏的目标，对痛风性关节炎具有一定的防治作用。本研究为临床应用提供了实验依据，为痛风在临床上诊治提供了新方向。

参考文献

[1] Mikuls TR，Saag KG. Gout treatment: what is evidence-based and how do we determine and promote optimized clinical care[J].Current Rheumatology Reports，2005，7( 3) :242．

[2]薛耀明，李晨钟．痛风的诊断与治疗[M]．北京：人民军医出版社，2006．

[3]董艳．IL-18在痛风炎症中的作用研究[D]．武汉: 华中科技大学，2011．

[4]王卫. NLP3炎症复合体在高糖培养的肾小管上皮细胞中的表达及其与细胞凋亡的关系[D]．山西:山西医科大学，2012.

[5]Chang HH，Wu CB，Chen YJ，et al．MMP-3 response tocompressive forces in vitro and in vivo[J]．J Dent Res，2008，87 ( 7) : 692-696．

[6]Hayami T，Pickarski M，Zhuo Y，et al． Characterization ofarticular cartilage and subchondral bone changes in the ratanterior cruciate ligament transection and meniscectomizedmodels of osteoarthritis[J]．Bone，2006，38( 2) : 234-243.

[7]宋艳芳.论浊毒与痛风尿酸毒性的相关性[J]. 陕西中医,2014，35(1)：62-63.

[8]姜德友，韩洁茹，谢颖，等．补肾利湿法防治痛风性关节炎的实验研究[J]．四川中医，2011，29(4) :26-28．

(收稿2015-10-09；修回2015-12-01)

通讯作者△

【中图分类号】R684.3

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.06.050

*国家自然科学基金项目( 81173170)