流式细胞仪在检测食品中微生物的应用研究

何方洋　万宇平　贾芳芳　吴小胜　罗晓琴　（①北京勤邦生物技术有限公司北京 昌平　102206　①北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心）

文献综述

流式细胞仪在检测食品中微生物的应用研究

何方洋①①万宇平①①贾芳芳①①吴小胜①①罗晓琴①①（①北京勤邦生物技术有限公司北京 昌平102206①北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心）

流式细胞仪（flow cytometer）是流式细胞术的商品化应用，它作为新型高科技仪器，已应用于临床医学、微生物学、海洋、渔业、酿酒、畜牧、体育科学、农业、林业、化工等领域，本文着重介绍了目前流式细胞仪在检测食品中微生物的应用研究。

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一项细胞分析技术，不仅能够快速定量分析和分选液流系统中单个细胞或其它生物微粒，而且可以实现分类收集特定细胞或细胞器。流式细胞仪（ flow cytometer）是流式细胞术的商品化应用，它作为新型高科技仪器，已应用于临床医学、微生物学、海洋、渔业、酿酒、畜牧、体育科学、农业、林业、化工等领域，随着科学技术的发展，流式细胞仪在检测食品中微生物方面应用发展起来［1］。检测食品中微生物是评价食品卫生的一个重要指标，目前发布的国家标准、行业标准以及地方标准中涉及到的食品中微生物的检测方法主要有：交叉引物恒温扩增检测方法、环介导恒温核酸扩增（LAMP）法、免疫磁珠法、分子分型SPA基因分型方法、荧光PCR法、Baird-parker琼脂培养基计数法、电泳和免疫印迹法、免疫色谱反应法、酶联免疫法等［2-10］。随着人们对食品安全要求的提高，相对于其他检测手段，流式细胞术已成为一种被认可的重要分析技术，利用细胞能够自发荧光，并且标记不同的荧光素（蛋白、核酸等），流式细胞仪通过散射光可以在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征。

1　流式细胞仪结构、原理及机型

1.1流式细胞仪结构流式细胞仪主要由五个部分组成：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统；细胞分选系统［11-13］。其中，流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，是液流系统的心脏。

1.2流式细胞仪原理由于超声振荡器产生高频振荡，使流动室发生振动，因此，能够把喷嘴喷出的细胞液流断裂成一连串的均匀小液滴，其中部分液滴含有细胞。在待测细胞形成液滴前，光学系统已测定出细胞的性质，如果发现了目标细胞，则在该目标细胞刚形成液滴时，仪器给整个液流充以短暂的正电荷或负电荷。当该液滴离开液流后，其中目标细胞的液滴就带有电荷，而其他细胞的液滴则不带电。带有正电或负电的液滴通过高压偏转板时，会发生向阴极或向阳极的偏转，从而达到了分类收集细胞的目的。整个仪器用多道脉冲高度分析器处理荧光脉冲信号和光散射信号，测定的结果用单参数直方图、双参数散点图、三维立体图和轮廓（等高）图来表示［14-16］。

1.3流式细胞仪基本机型目前，主要生产流式细胞仪的公司有德国的Partec公司、美国的BD公司和贝克曼库尔特公司［17-18］。仪器主要分为临床分析型和科研分选型，前者主要应用于临床实验室，后者则适于广泛的科研领域。随着电子制造技术、计算机技术、荧光素合成等技术的发展，流式细胞仪开始向模块化发展，其电子系统、光学系统、检测器单元等均可以按照试验要求随意更换［19-20］，以满足用户的不同需求。

2　流式细胞仪在食品微生物检测方面的应用

流式细胞仪曾经在第二次世界大战中用来检测细菌和孢子，后来随着流式细胞仪的商业化发展，用来检测哺乳类生物细胞，直到上世纪90年代末，由于仪器光学系统的改进，以及新荧光素的发现，流式细胞仪在微生物学的应用快速发展起来。而在食品工业应用中，流式细胞仪已被应用于酿酒、面包发酵、饮料等行业［21-23］，它已成为微生物检测的常用工具。

2.1应用于细菌活性的判断流式细胞仪能够鉴定食品中微生物的活性，因为活细胞具有完整的细胞结构，一般的荧光染料无法进入，只能进入细胞膜受损的细胞中。而有些染料可以进入所有死细胞和活细胞内，其进入量有差别。如果将两种特性的染料结合应用，配合荧光微球，即可快速鉴别并计数死/活细胞。该特性既可以评价食品的杀菌效果，也可以评价食品中有益菌的含量［24-26］。

2.2应用于食源性致病菌的检测目前，已有学术研究报道利用流式细胞仪检测生乳、果汁等食品中致病菌数量，这些报道同时也比较了平板计数法，结果发现流式细胞仪检测时间只需2h左右，而平板计数法则需要5d左右，而且在一定浓度范围内，前者具有更好的符合性，更加灵敏、准确、高通量，对液态食品的货架期、仓储、保质期、出口等顺利进行提供了高效的技术平台［27-29］。而在现实生活中，食品的生产、运输、消费过程均存在微生物污染的可能，食源性疾病是食品安全中最突出的问题，流式细胞仪已成为检测霉菌、酵母菌、大肠杆菌、沙门氏菌等多种病原菌的有力手段［30-32］。

2.3应用于食品中微生物的在线检测流式细胞仪能够检测食品中目标微生物的数量，能够同时检测多个样品，大大缩短了检测时间，因此满足了批量样品的在线检测需求。有人设计了一种低通量的流式细胞仪检测系统，能够实时、在线监测生物反应器中菌体生长的变化过程。与其他荧光检测方法相比，只有流式细胞仪可以从大量弱荧光信号的菌体中辨别出少量荧光信号强的菌体，由于流式细胞仪能够提供精确、可靠的检测结果，因此可以从中选择稳定的高产量理想菌株［33-35］。

3　结论与展望

流式细胞仪的使用解决了一些传统检测手段的缺点，比如检测周期过长，无法大批量检测样本［36-37］，流式细胞仪能够保持细胞结构、功能不被破坏，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号，对细胞进行定量分析或纯化分选，目前已成为食品中微生物质量检测的一种有力手段。然而，流式细胞仪在食品领域中的应用仅是冰山一角［38-42］，随着科学技术的发展，流式细胞仪的功能将越来越强大，逐步向仪器小型化，操作自动化的方向发展。

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