肛门洗剂对肛瘘模型大鼠TGF-β1/p-Smad3/MMP-1信号通路蛋白的影响

谢昌营， 赵晓娟， 吴成成， 肖慧荣， 万 玙， 黄海鹏

（江西中医药大学附属医院，江西南昌330006）



肛门洗剂对肛瘘模型大鼠TGF-β1/p-Smad3/MMP-1信号通路蛋白的影响

谢昌营， 赵晓娟， 吴成成， 肖慧荣*， 万 玙， 黄海鹏

（江西中医药大学附属医院，江西南昌330006）

摘要：目的 观察肛门洗剂对肛瘘模型大鼠创面愈合率及转化生长因子（TGF-β1）信号通路蛋白表达的影响。方法健康SD大鼠40只随机抽取10只，为正常对照组；余下30只建立肛瘘模型后，随机分为模型对照组、肛门洗剂组和阳性对照组。各组连续干预14 d。检测实验末各组大鼠TGF-β1信号通路相关蛋白及胶原蛋白co11agen I、co11agenⅢ表达水平。结果 与正常对照组相比，3组TGF-β1、p-Smad3、co11agen I、co11agenⅢ均上调，差异具有统计学意义（P＜0.05），且肛门洗剂组较模型对照组和阳性对照组的上调更为明显（P＜0.05）。与正常对照组相比，3组基质金属蛋白酶-1（MMP-1）均下调，差异具有统计学意义（P＜0.05），且肛门洗剂组较模型对照组和阳性对照的组下调更为明显（P＜0.05）。结论 肛门洗剂能激活TGF-β1信号通路，抑制MMP-1的表达，促进创面纤维形成，加速创面愈合，这可能是其治疗肛瘘的重要机制之一。

关键词：肛瘘；肛门洗剂；TGF-β1；p-Smad3；MMP-1

肛瘘是外科常见疾病，其不能自愈，不及时治疗会反复形成肛周脓肿，目前治疗方式多以手术切开为主，但术后创面愈合周期长是临床多年来的治疗难点。随着医学的发展，研究者们对肛瘘术后愈合的认识逐渐放到了转化生长因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）细胞信号转导通路上。TGF-β1是由多种细胞分泌的一类具有多重生物学效应的生长因子，在胶原代谢中发挥着重要桥梁的作用，参与了创面愈合、瘢痕形成的全过程［1］。属于Smads家族的Smad3作为TGF-β1的下游因子，其磷酸化后能够介导胞外刺激传递到核内，通过调控MMP-1的合成参与调节细胞外基质的动态平衡和组织纤维化［2］，进而对创面愈合产生重要影响。肛门洗剂是我院临床治疗肛瘘的有效中药外用复方，本实验通过复制肛瘘动物模型，同步检测各组实验大鼠TGF-β1信号通路蛋白的表达，探讨TGF-β1信号通路与肛瘘的关系及从细胞信号转导角度分析肛门洗剂治疗肛瘘的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 清洁级健康SD大鼠40只，雌雄各半，体质量200～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证批号SCXK（湘）2013-0004。饲养1周以适应环境。

1.1.2 主要药物与试剂 高锰酸钾（济南康福生制药有限公司，140203）；肛门洗剂（江西中医药大学附属医院，20140401）；氯胺酮（福建古田药业有限公司，KH140201）；TGF-β1抗体（美国Santa Cruz公司，SC-146）；p-Smad3抗体（美国CST中国分公司，#9520）；MMP-1抗体（美国Santa Cruz公司，SC-21731）；co11agen I抗体（美国Proteintech Group公司，14695-1-AP）；co11agenⅢ抗体（美国Proteintech Group公司，13548-1-AP）。

1.2 方法

1.2.1 分组 SD大鼠40只随机抽取10只，为正常对照组，余下30只建立肛瘘模型，将建模成功的实验大鼠随机分为模型对照组、肛门洗剂组及阳性对照组。

1.2.2 肛瘘模型建立 参照王琛等［3］方法，采用综合法制作肛瘘术后创面模型。术前对大鼠背部手术区域备皮，氯胺酮按100 mg/kg腹腔注射，麻醉后，在备皮区碘伏棉球常规消毒，距颈后2.5 cm处用创伤制作器在脊柱旁侧0.5 cm处切割直径约为1.8 cm的圆形创口，深达肌层，肌层伤口厚度约为0.3 cm，止血后在创面上加粪液1 mL，以油纱、敷料、胶带固定，48 h去除覆盖物，见伤口有脓性分泌物、有粪臭味者为造模成功。

1.2.3 给药方法 肛门洗剂由五倍子、苦参、明矾、芒硝、桑寄生、荆芥、黄柏、白及组成，将上药粉碎成粗粉，加水2 000 mL，浸泡15 min后武火煮沸，改文火再煎15 min，去渣存液，每150 mL为一包，使用时按1∶4稀释后擦洗创面，纱布包扎，每天2次。阳性对照组使用高锰酸钾，按1∶5 000稀释后擦洗创面，纱布包扎，每天2次。模型对照组用等量生理盐水擦洗创面，纱布包扎，每天2次。各组连续干预14 d。

1.3 样本采集与检测

1.3.1 创面愈合率 参照潘友珍等［4］方法测量创伤面积，并计算创面愈合率。愈合率=（原始创面面积-当前创面面积）/原始创面面积。

1.3.2 组织蛋白提取与检测 取创面肉芽组织，置入液氮冻存。取适量冻存组织按照约1∶8（质量∶体积）的比例加入组织裂解液混合，匀浆后涡旋混匀，静置1 h，18 000 rpm、4℃离心30 min，取上清，即为组织的总蛋白质，Bradford方法测定蛋白质浓度，分装备用。采用Western b1ot法检测目标蛋白，将50 μg肉芽组织总蛋白加入2× SDS上样缓冲液，100℃变性8 min，上样，恒定电流，前15 min 16 mA/ge1电泳，然后32 mA/ge1电泳至底部。转膜，封闭2 h后加入一抗4℃杂交过夜，加入二抗后再次室温杂交2 h，漂洗后ECL曝光显像，扫描，保存，分析。

1.4 统计学方法 所有资料进行正态性检验，用SPSS 17.0统计分析软件包进行处理，计量资料均采用±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，先进行方差齐性检验，方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Tamhane' T2法，显著性水准a=0.05。

2 结果

2.1 创面愈合率 各组实验大鼠创面愈合率见表1，显示肛门洗剂组和阳性对照组的创面愈合率明显优于模型对照组（P＜0.05），肛门洗剂组较阳性对照组，促进创面愈合效果更好（P＜0.05）。

表1　实验后各组间创面愈合率（±s，％）

注：与模型对照组比较，▲P＜0.05；与阳性对照组比较，*P＜0.05

组别　　动物数　　创面愈合率正常对照组　10—模型对照组　10　15.25±2.82肛门洗剂组　10　68.96±10.52▲*阳性对照组　10　45.76±8.13▲

2.2 实验后各组间TGF-β1、p-Smad3、MMP-1的表达 各组实验大鼠TGF-β1、p-Smad3、MMP-1的表达见表2、图1。表2显示，创伤3组TGF-β1、p-Smad3均上调，与正常对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），且肛门洗剂组较模型对照组和阳性对照组上调更为明显（P＜0.05）。创伤3组MMP-1均下调，与正常对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），且肛门洗剂组较模型对照组和阳性对照组下调更为明显（P＜0.05）。

2.3 实验后各组间co11agen I、co11agenⅢ的表达 实验后各组实验大鼠co11agen I、co11agenⅢ的表达见表3、图2。表3显示，创伤3组co11agen I、co11agenⅢ表达均上调，与正常对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），且肛门洗剂组较模型对照组和阳性对照组上调更为明显（P＜ 0.05）。

表2　实验后各组间TGF-β1、p-Smad3、MMP-1的表达（±s）

表2　实验后各组间TGF-β1、p-Smad3、MMP-1的表达（±s）

注：与正常对照组比较，▲P＜0.05；与模型对照组比较，*P＜0.05；与阳性对照组比较，#P＜0.05

1　p-Smad3　MMP-1正常对照组组别动物数　TGF-β 10　 0.12±0.02　 0.11±0.03　0.87±0.13模型对照组10　 0.19±0.03▲　0.22±0.04▲　0.52±0.10▲肛门洗剂组10　 0.54±0.12▲*#0.61±0.10▲*#　0.29±0.05▲*#阳性对照组10　 0.37±0.06▲*0.41±0.05*　0.41±0.07▲*

注：由左至右依次为正常对照组、模型对照组、肛门洗剂组、阳性对照组图1　实验后各组间TGF-β1、p-Smad3、MMP-1的表达

表3　实验后各组间collagen I、collagenⅢ的表达（±s）

表3　实验后各组间collagen I、collagenⅢ的表达（±s）

注：与正常对照组比较，▲P＜0.05；与模型对照组比较，*P＜0.05；与阳性对照组比较，#P＜0.05

组别　动物数　co11agen I　co11agenⅢ正常对照组10　0.12±0.01　0.14±0.02模型对照组　10　0.26±0.03▲　0.39±0.03▲肛门洗剂组　10　0.45±0.04▲*#　0.67±0.05▲*#阳性对照组　10　0.32±0.03▲*　0.37±0.03▲*

图2　实验后各组间collagen I、collagenⅢ的表达

3 讨论

肛瘘是临床常见的肛肠疾病，其发病率约为肛肠疾病总发病率的30％，合理的手术方式是治愈肛瘘的关键，但因术后创面多为开放性，同时由于支管残腔众多，故多存在术后愈合周期长等难以避免的治疗难点［5］。肛瘘术后创面修复和愈合是一个复杂而渐进的动力学过程，它包括早期各种细胞的聚集和受损组织的清除、细胞的移动和增殖、局部产生大量胶原基质及最后瘢痕形成过程，而其中起主导作用的便是TGF-β信号通路介导的纤维形成阶段［6］。TGF-β的3个亚型中，TGF-β1在创面愈合过程中的灵敏性和特异性较强，被认为与伤口愈合密切相关，能促进纤维化和瘢痕形成，同时，TGF-β1被公认为是最重要的成纤维细胞的强效趋化因子，是细胞外基质蛋白合成和降解的重要调节因素，它不仅能直接作用于成纤维细胞对基质的合成，而且是刺激肉芽组织形成的最有效的细胞因子［7］。在大鼠创伤模型中，TGF-β1是最早表明能加速创伤愈合的生长因子，局部应用TGF-β1的受体或中和抗体可延缓创面的修复过程［8］。进一步研究TGF-β1信号通路，发现Smad家族是最早被证实的TGF-β1受体激酶的底物，是负责将TGF-β1信号从细胞表面的受体传递至核内的关键信号分子，其中Smad3的羧基端可被TGF-β1磷酸化，而调控纤维形成的下游重要元件MMP-1的启动区域存在Smad3结合元件，使得磷酸化的Smad3在转位入核后可与之结合，从而直接作用于DNA，调节靶基因的转录，进而对创面愈合起到调控作用［9-10］。

肛门洗剂以清热解毒消肿、燥湿止痒止血为其基本功效，该洗剂由五倍子、苦参、明矾、芒硝、桑寄生、荆芥、黄柏、白及组成。五倍子味酸、涩，性寒，可治各种出血及痈肿疮疖。苦参味苦，性寒，《仁斋直指方》云：“治下部疮漏：苦参煎汤，日日洗之。”两者合而为君。明矾功效消痰，燥湿，止泻，止血，善治口舌生疮，疮痔疥癣。芒硝润燥软坚，清火消肿。两者合而为臣。桑寄生补肝肾、强筋骨，又治疮毒。荆芥善破结聚气，下瘀血，除湿痹，《简便单方》中治痔漏肿痛云：“荆芥煮汤，日日洗之”。黄柏味苦，性寒，治疮疡肿毒。《神农本草经》云白及“主痈肿、恶疮、败疽，伤阴死肌，胃中邪气”。诸药合用，共奏清热解毒、消肿燥湿之功。该中药复方为江西中医药大学附属医院肛肠科以五倍子汤为基础自拟的一种外科洗液，在临床安全、有效地使用了十余年。前期研究证实了肛门洗剂对于肛瘘、痔等肛周疾病具有改善患者临床症状、加速创面愈合的良好功效［11-12］。本研究中，与正常对照组比较，模型对照组实验大鼠TGF-β1信号通路相关蛋白有所升高，说明机体已通过TGF-β1信号通路启动了创伤修复程序，但经过肛门洗剂治疗后，局部TGF-β1信号通路被明显激活，能够促进创面愈合的TGF-β1及p-Smad3蛋白表达较模型对照组显著增高，而能够水解细胞外基质的MMP-1蛋白则表达降低，同时，创面愈合过程中的重要修复纤维co11agen I、co11agenⅢ的表达亦较模型对照组显著上调，且疗效明显优于阳性对照组。上述研究表明，相对于高锰酸钾的单纯杀菌作用，肛门洗剂除了具备清热解毒、消肿燥湿的效应外，更可能通过对TGF-β1信号转导通路进行干预性调节，从而抑制细胞外基质的降解，促进纤维的增殖，进而加速创面愈合，但具体机制尚需进一步研究。

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*通信作者：肖慧荣（1963—），男，主任医师，从事肛肠外科临床与实验研究工作。E-mai1：jxszyygck@126.com

作者简介：谢昌营（1984—），男，硕士，主治医师，从事肛肠外科临床与实验研究工作。Emai1：xcyxcy85091@126.com

基金项目：江西省教育厅科学技术研究项目（GJJ14618）

收稿日期：2015-02-11

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.038

中图分类号：R285.5

文献标志码：B

文章编号：1001-1528（2016）01-0167-03