外翻肠囊法研究波棱瓜子总木脂素纳米混悬剂的大鼠肠吸收特性

李娟娟， 申宝德， 程 玲， 邱 玲， 沈 刚， 武 娜， 袁海龙*， 尹蓉莉

（1.成都中医药大学药学院，四川成都611137；2.中国人民解放军第三○二医院，北京100039）



外翻肠囊法研究波棱瓜子总木脂素纳米混悬剂的大鼠肠吸收特性

李娟娟1，2， 申宝德2， 程 玲1，2， 邱 玲1，2， 沈 刚1，2， 武 娜2， 袁海龙2*， 尹蓉莉1*

（1.成都中医药大学药学院，四川成都611137；2.中国人民解放军第三○二医院，北京100039）

摘要：目的 利用肠外翻模型，研究波棱瓜子总木脂素纳米混悬剂（tota11ignans of Herpetospermum caudigerum nanosuspension，HTL-NS）在大鼠体外的肠吸收特性，并与波棱瓜子总木脂素混悬剂（tota1 1ignans of Herpetospermum caudigerum coarse suspensions，HTL-CS）进行对比。方法 以波棱甲素与波棱素在大鼠的肠吸收参数为指标，考察不同质量浓度HTL-NS在大鼠十二指肠、空肠、回肠的吸收状况。结果 HTL-NS中2种成分在各肠段的累计吸收量、吸收速率常数和表观渗透系数随着质量浓度的增加而增加，并且明显高于HTL-CS（P＜0.05或P＜0.01）；波棱甲素与波棱素在空肠吸收最好，而十二指肠与回肠的吸收无显著性差异（P＞0.05）。结论 HTL在体内的吸收可能为被动吸收，HTL-NS能有效改善HTL肠吸收。

关键词：波棱瓜子总木脂素；纳米混悬剂；外翻肠囊法；波棱甲素；波棱素

尹蓉莉（1952—），女，博士，博士生导师，研究方向为中药制剂。Te1：13689056666，E-mai1：yinrong1i@163.com

波棱瓜子是葫芦科植物波棱瓜Herpetospermum caudigerum Wa11.的干燥成熟种子。《中华人民共和国卫生部药品标准.藏药标准》1995年版波棱瓜子药材项下记载，其味苦，性寒，能清腑热、胆热，具有清热解毒、去火降热、助消化的作用，用于治疗肝热、黄疸性传染型肝炎等症［1］。本课题组经多年研究确定，波棱瓜子抗肝炎的有效部位为总木脂素，并将其开发成治疗慢性乙型肝炎的5类新药——肝能滴丸［2］。然而，波棱瓜子总木脂素（tota1 1ignans of Herpetospermum caudigerum，HTL）为难溶性成分，溶解度低、溶出慢限制了药物的吸收，进而影响其药效的发挥。

纳米混悬剂（nanosuspensions，NS）为一种普遍适用于难溶性药物的制剂形式，是采用少量表面活性剂或高分子聚合物作为稳定剂的“纯药物”粒子所构成的一种纳米分散体系。其处方简单，不含其他载体材料，载药量接近100％，药物以纳米状态存在，高度分散且比表面积大，能够提高药物的可润湿性、饱和溶解度及溶解速度［3］，利于药物的溶出和吸收，从而显著提高药物的生物利用度。

为提高波棱瓜子总木脂素的溶解度和生物利用度，本课题组前期采用高压均质工艺，制备波棱瓜子总木脂素纳米混悬剂（HTL-NS），结果表明，该方法能显著增加HTL的溶出度［4］。本实验以波棱瓜子总木脂素中2种有效成分波棱甲素和波棱素为指标，采用外翻肠囊法研究HTL-NS在不同肠段的吸收特性，并与波棱瓜子总木脂素混悬剂（HTLCS）进行比较。

1 仪器与材料

QE-300万能粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）；DZF-620真空干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司）；TGL-16GB台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；BAS124S电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；LC-20A岛津液相色谱仪（日本岛津公司）；XW-80A涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；GYB40-10S高压均质机（上海东华高压均质机厂）。

波棱瓜子饮片由江苏正大清江制药有限公司提供，经解放军302医院袁海龙研究员鉴定为葫芦科植物波棱瓜Herpetospermum pedunculosum Wa11.的干燥种子。波棱瓜子总木脂素（自制，批号140612）；波棱甲素对照品（自制，纯度大于98％，批号121205）；波棱素对照品（自制，纯度大于98％，批号121201）。十二烷基硫酸钠（SDS，北京凤礼精求商贸有限责任公司）；聚乙烯吡咯烷酮（PVPK30，北京凤礼精求商贸有限责任公司）。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯；K氏液［5］（称取CaC120.37 g、葡萄糖1.4 g，分别加少量蒸馏水溶解，再称取NaC1 7.8 g、KC1 0.35 g、NaH2PO40.32 g、NaHCO31.37 g、MgC120.02 g，加蒸馏水溶解后与溶解的CaC12及葡萄糖混匀，蒸馏水定容至1 L，即得pH=7.4的K试液）。

Wistar大鼠，雌雄各半，体质量（200±20）g，由军事医学科学院实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（军）2012-004。适应性喂养2 d后进行实验，实验前禁食12 h，自由饮水。

2 方法

2.1 HTL-CS及HTL-NS供试液的制备 采用高压均质法制备HTL-NS，称取1 g HTL加入到含0.2 g SDS和0.3 g PVPK30的100 mL K氏液中，充分搅拌混匀，高速剪切（10 000 r/min）5 min，即得HTL-CS。将所得HTL-CS转入高压均质机，在压力1 000 bar条件下高压乳匀10圈，即得HTL-NS［4］。

分别精密移取HTL-CS和HTL-NS适量，K氏液定容，配制成150、300、600 μg/mL（以HTL计）的低、中、高剂量的混悬液，作为肠囊供试液，备用。

2.2 肠吸收液样品的处理 精确移取HTL-CS或HTL-NS肠吸收液200 μL，氮气吹干，加入色谱纯甲醇300 μL溶解，超声3 min，涡旋1 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液，即得。HTL-CS、HTL-NS供试液及空白肠吸收液采用相同的处理方法。

2.3 方法学考察

2.3.1 HPLC色谱条件 Kromasi1-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-2％冰醋酸（22∶78）；体积流量为1.0 mL/min；检测波长为280 nm；柱温为室温；进样量为20 μL。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取波棱甲素11.80 mg、波棱素5.10 mg，甲醇溶解并定容至25 mL，制得含波棱甲素472 μg/mL、波棱素204 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3.3 专属性 比较波棱甲素、波棱素对照品溶液、空白肠吸收液、HTL-CS和HTL-NS供试液的色谱行为，发现各色谱峰处的杂质不干扰测定。见图1。

2.3.4 线性关系考察 精密移取适量混合对照品溶液于10 mL量瓶中，用K氏液稀释并定容至刻度，配制成一系列标准溶液。其中，波棱甲素的质量浓度分别为7.87、15.74、31.48、62.96、78.70、157.40、314.80 μg/mL；波棱素的质量浓度分别为3.40、6.80、13.60、27.20、34.00、68.00、136.00 μg/mL，于“2.3.1”项色谱条件下进行测定，以质量浓度（μg/mL）对峰面积进行线性回归，求得波棱甲素线性回归方程为Y1= 7 601.6X1-7 490.5，r=1.000 0，表明其在7.87～314.80 μg/mL内线性关系良好；波棱素线性回归方程为Y2=531.56X2-136.6，r=0.999 3，表明其在3.40～136.00 μg/mL内线性关系良好。

1.波棱甲素 2.波棱素 A.空白肠吸收液 B.混合对照品C.肠吸收液1 herpetrion 2.herpetin A.b1ank intestina1sac f1uid B.mixed reference substance C.intestina1sac f1uid图1　样品专属性试验Fig.1 Specificity tests for samp les

2.3.5 精密度 分别精密移取混合对照品溶液适量，用K氏液配制低、中、高（波棱甲素分别为15.74、31.48、62.96 μg/mL，波棱素6.80、13.60、27.20 μg/mL）3个质量浓度的对照品溶液，1d测定3次，计算日内精密度，发现2个成分的RSD均小于2％。每一质量浓度连续测定3 d，计算日间精密度，发现2个成分的RSD在1.5％～3.5％，符合生物样品分析要求。

2.3.6 稳定性试验 按“2.3.5”项下方法分别取低、中、高质量浓度的混合对照品溶液，置于37℃水浴中保温，分别在6、12、24 h取样，按照“2.3.1”项下色谱条件测定其含量变化，平行操作3次，计算平均值，与零时测定值比较。结果显示，不同质量浓度对照品溶液在37℃存放6、12、24 h后，3次测定平均值与零时测定值相差均在2％以内，表明稳定性较好，符合生物样品分析要求。

2.3.7 回收率试验 按“2.3.5”项下方法分别取低、中、高质量浓度的混合对照品溶液，依照“2.2”项下方法处理，每个质量浓度重复进样3次，分别测定峰面积，按“2.3.3”项下标准曲线方程求得药物质量浓度，比较测得与实际质量浓度，求得平均回收率。结果，波棱甲素与波棱素平均回收率分别为101.19％、102.05％，RSD分别为2.1％、2.3％。

2.4 大鼠离体肠外翻模型［6］将大鼠随机分为HTL-CS及HTL-NS高、中、低（相当于HTL 600、300、150 μg/mL）剂量6个组，每组5只。腹腔注射10％水合氯醛4 mL/kg，固定于手术板上，打开腹腔，取出十二指肠（距幽门1 cm处取10 cm）、空肠（距幽门15 cm处取10 cm）及回肠（盲肠上20 cm处取10 cm）。用K氏液灌流冲洗肠内容物，接着将小肠移至通入含5％ CO2混合氧气的K氏液中，小心剥离肠表面的脂肪和血管，冲洗干净后翻转，使小肠黏膜面向外，浆膜层向内。用手术线分别将翻转后的各肠段结扎成约10 cm长的小囊，并加入2 mL空白K氏液，并将其移入3个装有不同质量浓度的HTL-CS或HTL-NS供试液的玻璃试管中，保持37℃恒温，并持续通入混合氧气以保持离体肠管活性。分别在15、30、60、90、120 min时，从肠囊内取样0.2 mL，置于0.5 mL EP管内，并补入等量的肠营养液。实验结束后，测量各肠囊长度和内径。将各时间点样品按“2.2”项下方法处理，取续滤液20 μL，进样测定样品中波棱甲素及波棱素含有量。

2.5 数据处理［6-7］

药物吸收速率Ka： Ka=d Q/d t

式中，Q为药物单位面积累计吸收量（μg/cm2），Cn为n时间点实际检测质量浓度（μg/mL），A为肠段面积（cm2），Ka为药物吸收速率［μg/（min .cm2）］，d Q/d t为以药物的累计吸收量对时间作相关回归分析得出的斜率，Papp为表观渗透系数（cm/min），C0为0 min时肠囊外各成分的初始质量浓度（μg/ mL）。所得数据以±s表示，各组间数据比较采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，P＜0.05认为有显著性差异。

3 结果

3.1 HTL-CS与HTL-NS在不同肠段单位面积累积吸收量Q的比较 结果显示，HTL的吸收呈剂量依赖性增加，HTL-NS组中波棱甲素与波棱素的Q值显著大于同质量浓度HTL-CS（P＜0.05或P＜0.01）；与回肠组相比，2个成分在空肠吸收显著升高（P＜0.05或P＜0.01），十二指肠的吸收略有升高，但无显著性差异（P＞0.05）。因此，HTL-NS能显著提高HTL在大鼠小肠的吸收，见表1。

表1　HTL-CS与HTL-NS中的两个有效成分在大鼠不同肠段的Q值（±s，n=5）Tab.1 Q values of two effective com ponents（herpetrion and herpetin）in HTL-CS and HTL-NS in different parts of rats' small intestines（±s，n=5）

表1　HTL-CS与HTL-NS中的两个有效成分在大鼠不同肠段的Q值（±s，n=5）Tab.1 Q values of two effective com ponents（herpetrion and herpetin）in HTL-CS and HTL-NS in different parts of rats' small intestines（±s，n=5）

注：与HTL-CS比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与同剂量回肠比较，#P＜0.05，##P＜0.01

波棱甲素/（10-2×μg.cm-2肠段　HTL质量浓度/ （μg.mL-1）波棱素/（10-2×μg.cm-2）HTL-CS　HTL-NS　HTL-CS　HTL-NS十二指肠　150　0.83±0.14　2.04±0.21*）0.40±0.15　0.89±0.16 300　2.29±0.27　5.82±0.33**　0.93±0.13　2.18±0.24**600　6.38±0.45　13.84±0.47**##　2.71±0.27　5.88±0.31**##空肠　150　2.13±0.19#　5.37±0.25**##　0.93±0.18　1.94±0.11**##300　5.73±0.28##　13.94±0.54**##　2.01±0.18#　5.47±0.32**##600　12.37±0.53##　29.38±1.55**##　6.29±0.43##　14.38±0.788*##回肠　150　1.02±0.13　2.83±0.22**　0.54±0.13　0.97±0.21 300　2.78±0.27　6.59±0.31**　1.32±0.15　2.38±0.25**600　7.29±0.32　15.38±0.44**　3.28±0.24　6.93±0.37**

3.2 HTL-CS与HTL-NS在不同肠段的吸收速率Ka和Papp比较 由表2、表3可知，波棱甲素与波棱素的吸收参数Ka与Papp值在各肠段均按空肠、而回肠、十二指肠的顺序依次降低，空肠显著大于其他各肠段（P＜0.05或P＜0.01），回肠与十二指肠吸收无显著性差异（P＞0.05）；HTL-NS组中2个有效成分显著大于同质量浓度HTL-CS（P＜0.05 或P＜0.01）；随着药物质量浓度的增加，2个成分在各肠段的吸收参数均随之增大且无饱和现象。结果显示，波棱甲素与波棱素均在大鼠空肠吸收最好且吸收具有剂量依耐性，提示空肠为最佳吸收部位，吸收机制为被动扩散。

表2　HTL-CS与HTL-NS中两个有效成分在大鼠不同肠段的K a（±s，n=5）Tab.2 Kaof two effective com ponents（herpetrion and herpetin）in HTL-CS and HTL-NS in different parts of rats' small intestines（±s，n=5）

表2　HTL-CS与HTL-NS中两个有效成分在大鼠不同肠段的K a（±s，n=5）Tab.2 Kaof two effective com ponents（herpetrion and herpetin）in HTL-CS and HTL-NS in different parts of rats' small intestines（±s，n=5）

注：与HTL-CS比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与同剂量回肠比较，#P＜0.05，##P＜0.01

波棱甲素/［10-4×μg.min-1.cm-2肠段　HTL质量浓度/ （μg.mL-1］波棱素/［10-4×μg.min-1.cm-2］HTL-CS　HTL-CS　HTL-CS　HTL-NS十二指肠　150　0.82±0.09　2.23±0.52*）0.61±0.04　1.18±0.21 300　2.19±0.17　5.04±1.16**　0.95±0.08　1.89±0.62**600　5.54±0.42　13.86±1.19**##　2.74±0.11　5.52±0.95**#空肠　150　1.85±0.10　4.85±0.67**##　1.18±0.27　2.49±0.49**##300　6.52±0.44##　11.86±1.62**##　2.52±0.32##　4.51±0.72**##600　16.32±0.25##　35.57±2.08**##　7.50±0.29##　13.45±0.96**##回肠　150　0.95±0.10　2.73±0.46**　0.64±0.09　1.32±0.25**300　2.71±0.34　5.39±1.12**　1.07±0.09　2.50±0.69**600　7.30±0.513　15.64±1.15**　3.17±0.10　6.29±0.95**

4 讨论

外翻肠囊法作为一种离体药物吸收的模型，因操作简单、重复性好等优点在药物吸收及肠壁转运机制等方面得到了广泛应用［8］，可用于研究吸收促进剂和不同制剂的吸收作用及机制，寻找药物在小肠中的最佳吸收位置等［9-10］。此外，外翻肠囊模型保留了完整的组织和黏膜的特性，可在体外模拟体内生理状态下不同肠段对药物的吸收情况，研究结果可靠［6］。

表3　HTL-CS与HTL-NS中两个有效成分在大鼠不同肠段的P app（±s，n=5）Tab.3 Pappof two effective com ponents（herpetrion and herpetin）in HTL-CS and HTL-NS in different parts of rats'small intestines（±s，n=5）

表3　HTL-CS与HTL-NS中两个有效成分在大鼠不同肠段的P app（±s，n=5）Tab.3 Pappof two effective com ponents（herpetrion and herpetin）in HTL-CS and HTL-NS in different parts of rats'small intestines（±s，n=5）

注：与HTL-CS比较，**P＜0.01；与同剂量回肠比较，##P＜0.01

波棱甲素/（10-4×cm.min-1肠段　HTL质量浓度/ （μg.mL-1）波棱素/（10-4×cm.min-1）HTL-CS　HTL-NS　HTL-CS　HTL-NS十二指肠　150　3.66±0.40　9.92±2.33**　5.80±0.40　11.23±2.01 ）** 300　5.55±0.38　11.19±2.58**　4.50±0.38　10.98±2.97**600　7.27±0.47　15.41±2.33**　6.51±0.26　13.15±2.25**空肠　150　8.22±0.44##　21.57±2.98**##　11.25±2.58##　23.67±2.67**##300　14.48±2.57##　26.36±2.60**##　12.01±1.53##　23.49±2.44**##600　18.14±2.82##　39.52±2.31**##　17.89±0.71##　32.02±2.30**##回肠　150　4.21±0.43　12.14±2.04**　6.12±0.82　12.55±2.48**300　6.01±0.76　11.98±2.49**　5.09±0.47　11.92±2.92**600　8.12±0.57　17.37±1.28**　7.54±0.53　14.96±2.25**

波棱甲素和波棱素为波棱瓜子中发现的抗病毒活性成分，含有量高且活性强［11-12］。本实验以波棱甲素和波棱素为指标，采用外翻肠囊法研究比较HTL-NS与HTL-CS肠吸收特性，建立了同时测定HTL肠吸收液中波棱甲素和波棱素的HPLC方法。结果表明，HTL-NS的各吸收参数Q、Ka、Papp均显著高于HTL-CS（P＜0.05或P＜0.01），提示纳米混悬剂可改善难溶性中药有效部位吸收；HTL-NS 和HTL-CS在各肠段的累积吸收量为空肠＞回肠＞十二指肠，提示HTL在小肠最佳吸收部位可能为空肠；2种有效成分在150～600 μg/mL质量浓度范围内未发生饱和现象，吸收具有剂量和时间依赖性，符合Ficks扩散原理，提示其吸收机制为被动扩散。HTL制成纳米混悬剂后，肠吸收显著改善，分析原因可能为HTL制成纳米混悬剂后，粒径显著减小，比表面积增大，提高了药物的饱和溶解度，药物溶出快，吸收增加［13］。另外，纳米粒对黏膜的黏附性强，延长了药物在肠道的滞留时间，促进了药物的吸收［14］。本实验结果表明，纳米混悬剂可以作为增加难溶性中药有效部位在肠道的吸收，改善生物利用度，增强疗效的有效途径。

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Characteristics of rats' intestinal absorption of total lignans of Herpetospermum caudigerum nanosuspension by everted gut sacs

LI Juan-juan1，2， SHEN Bao-de2， CHENG Ling1，2， QIU Ling1，2， SHEN Gang1，2， WU Na2，YUAN Hai-1ong2*， YIN Rong-1i1*
（1.College of Pharmacy，Chengdu University of Traditional ChineseMedicine，Chengdu 611137，China；2.No.3O2 Hospital of PLA，Beijing 1OOO39，China）

ABSTRACT：AIM To investigate the characteristics of rats' intestina1absorption of tota11ignans of Herpetospermum caudigerum nanosuspension（HTL-NS）and compare the absorption difference between HTL-NS and the tota1 1ignans of Herpetospermum caudigerum coarse suspensions（HTL-CS）based on the everted gut mode1 in vitro. M ETHODS The intestina1absorption parameters of herpetrion and herpetin were the indices for the eva1uation of absorption characteristics of HTL-NS in rats' duodenum，jejunum and i1eum.RESULTS The overa11accumu1ative absorption，absorption rate constants and apparent absorption coefficients of HTL-NS，risingwith the increasing concentration，weremarked1y higher than those of HTL-CS at each intestina1 segment（P＜0.05 or P＜0.01）. There was existed absorption difference in herpetrion and herpetin in different intestine parts.The best absorption site was found in the jejunum，and no significant difference（P＞0.05）was observed in the duodenum and i1eum. CONCLUSION HTL shows its passive diffusion process，and HTL-NS can effective1y improve the intestina1absorption of HTL.

KEY WORDS：tota11ignans of Herpetospermum caudigerum nanosuspension；everted gut sacs；herpetrion；herpetin

*通信作者：袁海龙（1970—），男，博士，研究员，博士生导师，研究方向为中药新型给药系统。Te1：（010）66933367，E-mai1：yh1pharm@126.com

作者简介：李娟娟（1990—），女，硕士生，研究方向为中药新制剂、新剂型、新技术。E-mai1：714429827@qq.com

基金项目：国家新药创制重大专项（2015ZX09101025）；北京市科委重点项目（Z14110700220000）

收稿日期：2015-03-23

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.011

中图分类号：R969.1

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）01-0053-05