灵芝中三萜类化合物的研究进展*

孙培龙　陶文扬　何晋浙（浙江工业大学，浙江 杭州 310000）



灵芝中三萜类化合物的研究进展*

孙培龙陶文扬何晋浙
（浙江工业大学，浙江 杭州 310000）

摘要灵芝历来被认为是滋补强身、扶正固本的神奇珍品。近年来对灵芝的狂热研究发现其具有多种药理活性，在医药、保健和食品各领域都有很好的发展前景。灵芝富含三萜类化合物，是灵芝中十分重要的药理药效成分，对灵芝三萜类化合物的研究报道日渐增多。本文综述了灵芝中三萜类化合物对药理药效的贡献及其研究进展。

关键词灵芝；三萜类；研究进展

*本文为由中国食品土畜进出口商会、浙江省龙泉市人民政府、浙江省中药材产业协会、浙江省食用菌协会于2015 年8月在浙江龙泉联合主办的第一届中国灵芝大会的会议发言稿，经组委会同意，在本刊正式发表。

灵芝在我国已有2 000多年的药用历史，被历代医药家视为滋补强壮、扶正固本的神奇珍品，主要分布在中国、朝鲜、韩国等亚洲国家，2000年版的《中国药典》首次承认了灵芝的药用价值。目前，已被开发的灵芝产品主要有灵芝多糖、灵芝孢子粉、灵芝孢子油等，而单纯的灵芝三萜类的产品却未见报道。

灵芝中的三萜类成分主要分布在子实体的外周部分，含量随子实体成熟度的提高而递增。三萜类化合物有些很苦，有些无苦味，其含量因品种、培养条件和不同生育阶段含量有所差别，苦味的灵芝其三萜类化合物含量一般较高。近年来的研究发现，灵芝三萜类成分具有多种药理活性，使其越来越受到研究者的重视，研究日益深入，相关文献日渐增多。

1　灵芝三萜类成分的结构

1982年Kubota T.等首次从赤芝子实体中分离获得灵芝三萜类化合物[1]。根据灵芝三萜化合物分子中所含的碳原子数，分为C30、C27和C24三大类[2]。三萜类化合物多为四环三萜和五环三萜，链状、单环、双环和三环三萜较少。四环三萜常见的结构类型有达玛烷型、环阿屯烷型、羊毛脂烷型、甘遂烷型、葫芦烷型；五环三萜主要包括齐墩果烷型、羽扇豆烷型、何伯烷型、乌苏烷型和木栓烷型[3]。

灵芝三萜类化合物是一类高度氧化的羊毛甾烷衍生物，存在于灵芝的中性组分和酸性组分中，在脂质中溶解度较高。灵芝三萜类化合物结构中一般都含有羟基，且在紫外光谱中呈现多个波长的吸收特征，这一特点为灵芝三萜类成分的研究提供了方便。其中，灵芝酸作为灵芝三萜类化合物中重要的活性成分，根据官能团和侧链的差异，又可分为灵芝酸、灵芝内酯、灵芝醇、赤芝酸等基本骨架[4]。不同的侧链连接点对三萜类物质的活性有不同的影响，Fatmawati S.等研究表明，C11位的官能团对其药理作用的影响较大，并且C3、C7和C15位所连接的羟基取代基对醛糖还原酶的抑制作用很重要[5]。

2　灵芝三萜类化合物的提取方法

2.1常规溶剂提取法

灵芝三萜类化合物结构相似，难溶于水，易溶于有机溶剂，较不稳定，因此难以分离和纯化。常采用甲醇、乙醇、氯仿或乙酸乙酯等有机溶剂在常温或高温下回流提取。不同溶剂、浓度、提取环境对提取效果有明显影响。杨德等探究乙醇浓度对灵芝三萜类成分的提取率的关系，发现其与乙醇浓度呈正相关关系[6]。侯敏娜等采用正交试验方法探究了灵芝三萜的最佳提取方法，得出最佳的提取工艺为5倍量95%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，最后得到产物的总三萜类含量为9.07%[7]。Fatmawati S.等将灵芝子实体在室温下用氯仿提取3次，浸泡24 h，所得浸膏经碱提酸化后再由氯仿萃取得到三萜酸浸膏，提取率为1.99%[8]。

2.2超声辅助提取法

从灵芝子实体或孢子粉中提取三萜类物质时，溶剂回流提取法因受其结构影响，花费时间较长，而采用超声波处理破坏灵芝的致密结构，可缩短提取时间一半以上[9]，目前已得到广泛应用。Keypour S.等和Liu Y.L.等采用超声波辅助提取，以氯仿为提取溶剂，提取液过滤后浓缩得三萜类浸膏，其提取率在1%～1.5%[10，11]。黄晓巧等人研究了灵芝三萜类成分超声提取的最佳条件，发现最佳提取工艺是加40倍量甲醇，超声提取3次，每次30 min[12]。

2.3微波辅助提取法

微波提取技术是近年来发展起来的新型提取技术，具有选择性强、耗时少、能耗低、排污量少等优点，是目前天然产物提取的创新技术。该技术利用产生的高频电磁波，穿透组织外层结构而迅速到达组织内部，使组织内部温度和压力迅速升高，导致细胞破裂，有效成分自由流出。卢彦芳等设计微波连续抽提的方法，并与其他传统提取方法进行比较，发现微波连续抽提和常规的微波萃取分别需要14.5 min和10 min即可达到灵芝三萜类成分的最大提取量，而其他非微波提取的常规方法则需要几十分钟甚至上百分钟，且微波连续抽提所得产物的纯度远远高于其他方法[13]。

2.4超临界萃取法

超临界CO2提取（supercritical fluid carbon dioxide extraction）技术是一项把萃取和分离合二为一的新型技术，该技术与传统的化学溶剂提取法相比，不仅工艺简单、能耗低，活性成分不易被破坏，而且具有无污染、无化学溶剂消耗和残留的优点，被称为绿色生物萃取分离技术。高宇杰等尝试使用超临界CO2提取法萃取灵芝三萜类成分，并用正交试验获得最佳萃取分离条件为：萃取压力30 MPa，萃取温度40 ℃，压力8 MPa，温度56 ℃，在此条件下灵芝三萜类成分的得率为38.14 g/kg[14]。贾晓斌等人比较了超临界CO2流体萃取法和醇回流提取法提取效果的优劣，发现这两种方法得到的三萜类成分的色谱图具有相似的峰形，灵芝三萜和灵芝酸B含量相近，而固形物含量则以醇回流法为高[15]。

3　灵芝三萜类成分的生理活性

3.1抗肿瘤作用

灵芝可以通过抑制肿瘤细胞的分裂与增殖、促进肿瘤细胞死亡、抑制肿瘤细胞的侵袭和转移、调节免疫系统，以及辅助常规治疗等方法发挥抗肿瘤作用[16]。Liu R.M.等从灵芝发酵菌丝中分离得到一对位置异构体：灵芝酸Mf和灵芝酸S，随后的MTT实验表明，二者均能够抑制人体的多种癌细胞株的增殖[17]。刘峰等探究灵芝三萜类物质在小鼠体内的肿瘤抑制能力，发现灵芝三萜组分GLE对S180肉瘤小鼠及前期研究的H22肝癌小鼠体内具有一定的抗肿瘤作用[18]。

Nguyen V.T.等人从越南灵芝中分离出了两类新的三萜类化合物，其中一种对PC-3细胞有明显的抑制作用，而已发现的16种三萜类化合物中有一种表现出了强有力的阻碍血管生成的能力[19]。

3.2抗炎作用

Dudhgaonkar S.等研究发现，灵芝三萜能够抑制由脂多糖（LSP）引起的各种炎症反应[20]。Ko H.H.等从赤芝和松杉灵芝中共分离获得12种三萜类和甾醇类化合物，其中化合物10通过FMLP/细胞松弛素B（CB）的刺激，对大鼠中性粒细胞甲酰基β-葡萄糖醛酸酶的释放有明显的抑制作用；化合物9还可以防止紫外线对人类角质形成细胞B（UV-B）造成的光损伤，从而可以保护细胞免受光损伤[21]。

Hasnat M.A.等研究发芽的糙米上长出的灵芝的生理活性情况，通过免疫荧光法发现，其可抑制结肠炎小鼠的NF-kB通路；而通过免疫组织化学着色法发现了COX-2和IL-1β的表达，最后的动物学实验表明，这类灵芝的三萜类提取物可以显著缓解结肠炎小鼠的病情[22]。

Choi S.等发现，从灵芝RAW264.7细胞中提取的三萜类成分可以通过AKT-Nrf2通路对血红素氧合酶-1施加影响，为灵芝三萜类成分的抗炎能力的机制提出了一个新的研究方向[23]。

3.3护肝作用

黄宗锈等采用经典的CCl4模型，同时给予动物低、中、高剂量的灵芝三萜，通过血清生化指标的检测，发现灵芝三萜能够明显抑制CCl4引起小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的升高，此外灵芝三萜还能使肝脏组织形态学上的肝细胞变性、坏死程度得到明显的改善和恢复，表明灵芝三萜类成分对CCl4引起的肝脏损伤有较好的保护作用[24]。鲍琛等发现，灵芝三萜类成分对高脂饲料所致非酒精性脂肪肝小鼠具有保肝调脂作用，其高、中剂量的灵芝三萜类成分都明显表现出了对肝脏的保护作用，可以降低非酒精性脂肪肝小鼠肝脏中TG、TC、丙二醛（MDA）含量，提升超氧化物歧化酶（SOD）的活力，且通过组织病理学检查后发现，小鼠脂肪肝程度和肝细胞坏死程度有明显减轻[25]。

Liu L.Y.等从茶病灵芝中提取了10类三萜类成分，其中有5种是新发现的三萜类，且有6类在细胞学试验中表现出了护肝作用，保护了HL-7702细胞不被DL-半乳糖胺诱导产生细胞损伤[26]。

3.4抗病毒作用

Min B.S.等从赤芝孢子粉中分离得到了灵芝酸，体外试验表明其对HIV-1蛋白酶活性有明显抑制作用，其IC50为20 μmol /L[27]。

Sato N.等研究表明，从赤芝与紫芝中提取分离得到的三萜类物质，对HIV-1病毒、HIV-1蛋白酶均有一定的抑制作用。赤芝中的灵芝酮三醇和灵芝醇F可抑制由HIV-1诱导的MT24细胞的细胞毒性效应。在抗HIV-1 蛋白酶实验中，赤芝中的灵芝酸B和灵芝醇B对HIV-1蛋白酶的活性有较强的抑制作用，从紫芝中分离到的灵芝酸GS-2、20-羟基赤芝酸N、20(21)-二羟基赤芝酸N和灵芝醇F对HIV-1蛋白酶的活性也有一定的抑制作用，IC50在20～40 μmol /L[28]。

Zhang W.等发现，Lanosta-7,9(11),24-trien-3-one,15;26-dihydroxy (GLTA) 和Ganoderic acid Y （GLTB）两类灵芝酸可以抑制肠病毒71对人体的感染，通过与肠病毒71反应来阻止肠病毒71吸附正常细胞，进而保护人体免受肠病毒71的侵害[29]。

3.5抑菌作用

灵芝三萜类化合物对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌都有一定的抑制作用。刘高强等人对灵芝三萜类成分的抑菌能力进行研究后发现，赤芝发酵菌体中的三萜类化合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及青霉、黑霉均有明显的抑制作用，其最小抑菌浓度分别为25 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL、50 mg/mL和100 mg/mL[30]。Li W.J.等通过液－质联用方法，从黑芝中分离获得8种灵芝酸，经体外抑菌试验发现，8种灵芝酸对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌和大肠杆菌均有明显的抑制作用，在抗菌制剂应用方面有潜在的药用价值[31]。

3.6抗氧化能力

刘丙进等研究发现，灵芝三萜类化合物可能通过增强机体清除氧自由基的能力和抗氧化功能，减轻自由基的损伤效应，减少脂质过氧化反应的发生和脂质过氧化产物的生成，维持细胞内环境的稳定，从而起到保护细胞，延缓衰老的作用[32]。周晓等人通过DPPH法和羟自由基清除法研究灵芝三萜类成分的抗氧化能力，发现灵芝三萜类具有较强的抗氧化能力，且随着浓度的增加而变强，而经超声辅助提取法获得产物的抗氧化能力要高于传统浸提法[33]。

3.7其他

（1）减少哮喘。Liu C.等发现，灵芝酸C1可以减少哮喘病人的外周血单核细胞产生的LPS诱导的TNF-α，或能为哮喘治疗提供一个新的研究方向[34]。

（2）治疗皮肤冻伤。Shen C.Y.等制造了基于纳米脂质载体的外用灵芝三萜类胶体，其可用于治愈皮肤冻伤，且效果明显高于无载体灵芝三萜类胶体[35]。

（3）抗辐射。Smina T.P.等评估了灵芝中三萜类成分阻止γ辐射诱发的小鼠肝细胞线粒体和微粒体膜损伤的能力，以及用于体内间接疗法治疗pBR322质粒DNA受γ辐射引起的DNA断裂的可能性，结果表明灵芝三萜类成分可以有效防止由辐射引起的膜损伤和DNA的断裂[36]。

（4）抗疟原虫。Ma K.等从灵芝中提取了9类三萜成分，其中的1、2、6成分具有较好的抗疟原虫能力，而5、7、8、9成分会与LXRβ产生竞争效果，其EC50值分别为203.00 nM、8.32 nM、257.00 nM、86.70 nM[37]。

（5）降血糖。Ma H.T.等通过动物实验发现，灵芝三萜类成分可以通过抑制糖醛还原酶与α-葡糖苷酶的活性，进而抑制餐后的血糖上升，可以作为糖尿病症的辅助药剂[38]。

4　讨　论

随着对灵芝活性成分的研究越来越深入，对灵芝三萜类化合物的结构与药理药效也越来越清楚，但是，科学家们对灵芝三萜类化合物在人体中的作用机理机制还不是很清楚，这大大限制了灵芝三萜类化合物的应用。根据多年的前沿跟踪调研，笔者认为今后一个阶段对灵芝三萜类化合物的研究，将集中在灵芝三萜类化合物的分析检测方法、分离纯化方法、药理药效机制及与其他灵芝有效成分的协同作用等方面。只有这四大领域全部都取得明显的进展，灵芝三萜类化合物的应用时代才会真正到来。

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研究发现灵芝可缓解放化疗引起的肠胃道损伤

放、化疗之所以会引起恶心、呕吐、食欲不振等副作用，主要是因为药物或放射线损伤胃肠道细胞，造成胃肠道黏膜发炎所致。情况严重的，会出现腹痛、腹泻，更严重者，甚至会因为黏膜屏障严重损坏而引发全身性的病毒或细菌感染，导致多重器官衰竭，使生命受到威胁。

（1）灵芝多糖可加强胃肠道的自我修复能力。从一些肿瘤患者的实际应用经验可知，以灵芝相关制剂协同放化疗，不易出现上述的胃肠道症状，或症状比较轻微。经实验观察从灵芝子实体萃取出的灵芝多糖gi-ps，对小肠上皮细胞株有保护作用。实验显示，以不等剂量(0.1、1、10或100μg/ml)的gi-ps和小肠上皮细胞一起培养，有促进细胞增殖的作用。

（2）动物实验证实，灵芝多糖能减轻肠道损伤、提升肠道免疫。mtx是治疗癌症常用的化疗药，“把该药给予实验对象的第二天，就会出现体重减轻、毛发脱落、进食和活动减少等现象；到了第三四天，这些情况将更明显。”该实验进行如下：连续十天给实验对象灌胃不等剂量的灵芝多糖(50、100或200mg/kg)，并于实验第七和八天为实验者注射mtx，结果发现，小肠黏膜受到的破坏明显减轻，丙二醛mda(细胞膜遭受自由基攻击后所产生的氧化产物)减少，超氧气化酶sod(负责清除自由基的酵素)增加，lga抗体(肠道最主要的免疫指标)含量上升。整体来看，灵芝多糖对mtx化疗药的肠道损伤有减轻作用，并提升肠道免疫功能。（文/陈静）

（摘编自2015.12.23《姑苏晚报》http://difang.gmw.cn/newspaper/2015-12/23/content_110335023.htm）

中图分类号：S567.3+1

文献标识码：A

文章编号：2095-0934（2016）02-076-06