关节软骨下骨血管新生的研究进展

徐汛 马金忠

关节软骨下骨血管新生的研究进展

徐汛 马金忠*

骨关节病是一种很常见的疾病，其导致的疼痛及功能障碍对人体健康及生活质量有很大影响，但其发病原因及病理机制尚未完全清楚。近年来，骨关节病患者的软骨下骨改变及血管新生备受重视。本文就骨关节病与软骨下骨血管新生的关系及其研究进展作一综述。

软骨下骨；血管新生；骨软骨交界；促血管生成因子

骨在持续不断的重塑，以此来保持其大小、形状及结构的稳定性，血管新生在生理性骨生长及骨重塑中起着重要作用，同时在病理性骨病中也起着重要作用，如骨关节炎、骨折修复、骨坏死、肿瘤骨转移等[1]。骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种很常见的疾病，其导致的疼痛及功能障碍对人体健康及生活质量有着很大影响，目前认为骨关节炎是一种全关节疾病，它不仅仅是一个磨损过程，更确切的说是关节退化及异常重塑过程[2]。近年来越来越多的文献报道了它与软骨下骨血管新生的关系，因而深入了解血管新生与骨关节炎的关系以及软骨下骨血管新生的机制，也许能帮助发现骨关节病新的诊断的生物学标志及新的治疗靶点。

1 血管新生与骨重塑

血管新生（Angiogenesis）是由组织中既存的成熟血管的内皮细胞发生增殖和游走，形成小的血管。包括一系列步骤:①原有血管基底膜降解并引起毛细血管芽的形成和细胞迁移；②内皮细胞向刺激方向迁移；③位于迁移细胞后面的内皮细胞增殖和发育成熟[3]。

成熟的关节软骨可分为表浅层、移行层、放射层及钙化软骨层四层，软骨下骨由骨密质及骨松质构成，骨密质为一层薄板，称软骨下板（Subchondralplate），骨软骨交界（Bonecartilage interface）即是由钙化软骨层及软骨下板构成。钙化软骨层由于富含钙盐，结构致密，从而限制软骨下骨的小分子物质扩散进入非钙化软骨，维持了软骨生理微环境的稳定[4]，因而骨软骨交界的完整性对于维持软骨的结构及功能具有重要意义。骨软骨交界是一个复杂的功能单位，生物力学和生物作用会导致骨软骨交界成分、结构和功能性质的改变，而作为一个功能单位，一个组分的改变会影响其他组分，使病情恶化[5,6]。

正常生理条件下，人类软骨既不含血管，也不含神经，具有抵抗血管侵入的能力，这不仅取决于上述骨软骨交界的屏障作用，还有赖于促血管生成因子与抗血管生成因子之间的平衡。而骨关节炎患者的软骨则能被软骨下骨的血管侵入，软骨下骨血管新生在骨关节炎中扮演着重要角色，但其机制尚未完全清楚，目前的研究多集中于骨软骨交界结构的破坏以及促血管生成因子与抗血管生成因子之间的失衡。有研究认为在骨软骨交界处的血管新生主要取决于从软骨下骨与非钙化软骨之间通道的形成，与此同时，促血管生成因子与抗血管生成因子表达都上调，但前者占优势[7]，于是抗血管生成因子失去其拮抗血管生成的作用，形成有利于血管内皮细胞迁移增殖的微环境，最终导致软骨下骨血管新生，并侵入骨软骨交界区及非钙化软骨。SunitaSuri等[8]认为软骨下骨过多的破骨活动导致软骨下板到非钙化软骨之间通道的形成，同时软骨表面的裂隙就向下延伸到了软骨下板，于是关节软骨下的液体、细胞及细胞因子等持续增加，导致软骨下骨不正常的血管新生。由于软骨下骨与软骨之间的通道的产生与软骨的微裂缝及微小孔洞有关[9]，因而机械应力及年老是引起骨关节炎的重要因素，尤其是肥胖和关节畸形等异常应力的作用。

可以说，软骨下骨血管新生与骨重塑有着十分密切的关系，C.Mathieu等[10]人工制造了成熟兔膝关节损伤，对关节软骨损伤下软骨下骨血管新生进行了体视学分析，发现软骨下的血管新生可由壳聚糖植入间隙引起，这可以抑制纤维软骨疤痕组织形成，促进骨重塑，允许更多的血管植入，并且促进非板层骨朝损伤部位修补。当新生血管跨越骨软骨交界，植入非钙化软骨层时，就会导致软骨内钙化，这种钙化以软骨细胞病理性肥大、软骨内碱性磷酸酶活性增加及微晶体的积聚为特点，至少部分解释了钙化软骨层增厚及潮线重复现象[11]。无疑，这种骨重塑是不正常的，它导致了关节软骨结构稳定性的破坏，同时可能还会进一步累及关节其他部位。可以说，软骨下骨的血管新生是OA的早期病变，OA中骨－软骨复合单元的血管增生与软骨退变相关。袁雪凌等[12]的研究证明了这一点，他们还发现血管侵入软骨的数量密度与OA发展呈时间依从性增加变化。不得不提的是，促血管新生因子不仅能促进血管新生，可能也会促进神经生长，并且血管细胞产生的分子也会刺激和诱导神经生长。感觉神经随着新生血管长入关节，最终进入非骨化关节软骨、骨赘及半月板内部，因此血管新生既导致结构的破坏，还导致疼痛的发生[7,13]。

2 促血管生成因子

血管生成因子对骨重塑十分重要，Mabey T等发现正常人和OA病人血浆中的血管生成因子的含量是不同的，局部及循环中的血管生成因子对血管新生起重要作用[14]。破骨细胞、成骨细胞、骨细胞是骨重塑中的三种主要细胞，它们能够产生大量血管生成因子来影响血管新生，为骨重塑提供足够的血供[1]。此外，血管生成因子还与炎症细胞有关，血管新生与炎症紧密联系。炎症部位的低氧很常见，低氧增加血管内皮生长因子（VEGF）的产生，从而诱导血管新生。炎症细胞如巨噬细胞可以直接产生促血管生成因子 VEGF等，也可通过产生肿瘤坏死因子 （TNF-）来促进血管生成因子的产生，同时TNF-也可产生蛋白水解酶MMP-9和MMP-14，这有利于血管进入细胞外基质。同时，血管新生反过来又有利于炎症的发展，许多血管生成因子如VEGF等都有促炎作用，在这种相互作用下，炎症往往呈持续性[4,11]。

2.1 血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF）

VEGF最初在牛垂体滤泡细胞中发现[15]，是一种分子量为34～45kDa的同型二聚体糖蛋白，它有5种不同的异构体，其中以VEGF165最常见，也是最主要的作用因子。也有人认为人类 VEGF家族包括5个分泌型同型二聚体糖蛋白:VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子，通常所说的“血管内皮生长因子”即指VEGF-A[16,17]。VEGF的活性受到结缔组织生长因子（CTGF）的调控，CTGF可与VEGF形成复合体，使VEGF失去活性，但这一过程可被基质金属蛋白酶解除[11,18]。VEGF可由破骨细胞、成骨细胞、骨细胞以及软骨细胞产生，机械应力，尤其是过大的机械应力在骨软骨细胞产生 VEGF的过程中发挥了重要作用[19,20]，炎症对VEGF的产生亦有极大的影响，除局部低氧外，体外实验证明 TNF-可诱导骨细胞凋亡，这个过程中VEGF表达大大增加[21]，同时其产生的蛋白水解酶MMP-9和MMP-14可降解细胞外基质，使其中的CTGF释放出来，进一步增加VEGF的产生。此外，郭静等[22]通过自愿捐赠的60例OA及20例正常关节软骨与滑膜标本，免疫组化检测 IL-18、VEGF及 NF-B p65蛋白表达，原位杂交检测IL-18及VEGFmRNA表达；并进行相关性分析，发现IL-18在OA软骨和滑膜组织的高表达可能激活NF-B信号通路，而NF-B信号通路激活则可能上调了VEGF的表达。

VEGF的主要作用是促进血管生成，它是针对内皮细胞特异性最高、促血管生长作用最强的有丝分裂原[23]，VEGF与内皮细胞表面具有高亲和力的酪氨酸激酶受体结合后，诱导黏附分子表达，并释放细胞因子和趋化因子，引起血管基膜降解，使得内皮细胞更易进入周围组织而促进新生血管生成[24]。此外，VEGF直接刺激内皮细胞的存活、增殖及分化[23]，可以说它直接或间接的参与了血管新生的每一个环节。其诱导生成的血管主要集中在滑膜组织与骨软骨连接处[25]。

2.2 表皮生长因子样家族成员（Epidermal growth factor（EGF）-like family members）

EGF最早在1962年由Cohen等在小鼠颌下腺中发现。此后，许多科学家在这一领域进行了大量的研究，发现EGF对多种上皮细胞及内皮细胞具有强大的促进生长作用，同时它还能促进透明质酸、纤维连接蛋白、糖蛋白等细胞外基质的合成[26]。这个家族包含以下典型成员:EGF、HB-EGF、TGF等，现已在成骨细胞、破骨细胞以及内皮细胞中检测到他们的表达[1]。如 EGFL2、EGFL3、EGFL5、EGFL6、EGFL7、EGFL8、EGFL9已在骨局部微环境中发现[27]，这是它们在血管新生中起作用的重要提示。Bertrand-DuchesneM-P等[28]在体外实验中发现血小板血浆中的EGF可显著的促进脐静脉血管内皮细胞的增殖，虽然他们认为还需进一步的体外实验加以证实。此外，HB-EGF通过刺激一氧化氮合成酶及一氧化氮的产生，可诱导血管内皮细胞的迁移[29]，TGF可刺激新毛细血管的形成[1]等。这些都说明 EGF样家族成员具有促血管生成功能，它们在软骨下骨血管新生中发挥重要作用。

2.3 基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase,MMP）

MMP是一种含有锌结构的内肽酶，被认为是最重要的一类细胞外基质降解酶，MMP家族的活性主要依赖锌离子和钙离子结构，具有一定的同源性，并且结构具有高度的恒定性[30]。MMP可由成骨细胞、破骨细胞、骨细胞等产生，同时，EGF、以及由巨噬细胞分泌的炎症介质TNF-、IL-1等也可促进MMP的表达。MMP通过降解细胞外基质，为血管内皮细胞的迁移提供重要条件，是促血管新生的重要因素。Tomohiro Kato等[31]发现IL-1刺激滑膜成纤维细胞产生的细胞外体可以上跳MMP-13的表达。MMP与VEGF之间存在着十分密切的相互作用，VEGF可刺激 MMP-1和MMP-3的表达，而MMP可以通过解除CTGF/VEGF165复合体来恢复VEGF的活性[11]。在基因表达方面，WNT-诱导信号蛋白1（WISP-1）的表达增加会上调MMPs的表达[32]。2.4肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor,HGF）、缺氧诱导因子（Hypoxia-inducible factor,HIF）及其他

HIF是Semenza等人于1991年在缺氧诱导的肝细胞癌株Hep3B细胞核提取物中发现的一种转录因子[33]，直接或间接调节着血管生成、细胞增殖与凋亡、能量调节等众多通路。HIF的表达由低氧诱导，多由软骨细胞表达，而低氧在炎症部位很常见。关节软骨的稳态与HIF-1和HIF-2之间的平衡有关，当 HIF-2增多时，则会导致软骨细胞的凋亡及软骨内骨化[34]。而 HIF-1及 HIF-2均可诱导血管新生[35,36]。此外，HIF还可上调VEGF及MMP的表达[5,37]，从而间接促进血管新生。

HGF由Nakamura等于1984年首次发现，它通过使它的受体 C-Met酪氨酸磷酸化，与之结合后起作用，调控下游信号。在OA中，HGF定位于钙化软骨层及软骨的深层，HGF主要由软骨下板的成骨细胞合成，然后向软骨区扩散，当然软骨细胞也可合成一部分HGF。HGF从软骨下骨向软骨扩散的过程，从一方面证明了上述的骨软骨连接处信号传导的作用以及其结构破坏对血管生成和疾病发展的影响。HGF是骨吸收强有力的抑制剂，但它同时能增强成骨细胞的作用，这表明其对骨重塑有很重要的作用。EASTEWART等发现HGF能促进细胞增殖及血管新生。此外，HGF还可促进MMP、胶原酶-3、Ⅱ型胶原等的生成，从而进一步促进血管新生[5,8,38]。

还有许多促血管生成因子，如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、内皮素-1（ET-1）、NF-B受体激活蛋白配体（RANKL）、骨形态发生蛋白（BMP）等在血管新生中起到十分重要的作用。此外，C.Mathieu等还发现软骨下的血管新生由壳聚糖植入间隙引起，而植入由原位凝血导致，此过程可以被凝血因子加速[10]。总之，软骨下骨血管新生是一种多因素、多因子调控的过程。

3 治疗方向

既然软骨下骨血管新生在关节病变，如OA中起着十分重要的作用，那么血管新生就可以作为新的治疗靶点，理解血管生成因子在骨局部微环境中的作用，就有利于新治疗靶点的发现，为分子靶向治疗提供可能。以下列举几种可行的潜在治疗方式。贝伐单抗是一种血管内皮生长因子抗体，可以抑制血管新生，Toshihiro Nagai等[39]用前交叉韧带横断的兔模型及正常兔的对比研究发现，贝伐单抗能够防止关节软骨及滑膜炎中的血管新生，从而减轻滑膜炎、骨赘形成及软骨退行性变，更重要的是，关节内给药可以减轻疼痛，而且在组织学上，贝伐单抗对正常关节没有负面影响。贝伐单抗只是与VEGF结合，并不能减少VEGF的表达。他们认为前交叉韧带损伤后早期使用贝伐单抗能延缓创伤后OA的发展，并且关节局部给药要优于全身给药。此外，许多二膦酸盐类（如阿仑膦酸钠、利塞膦酸、替鲁磷酸盐及唑来膦酸等）也可减轻软骨内血管侵入，抑制软骨下骨重塑，减少软骨下骨骨质流失及骨赘形成[5,40]。有研究表明，虫草素在抗炎、抗血管新生等方面具有重要作用，胡鹏飞等[41]发现虫草素能减少IL-1刺激的粘多糖的表达，以及COX-2、iNOS和一氧化氮的表达，同时虫草素还能减少MMP-1及MMP-13的表达。

血管新生在骨性关节炎等关节疾病中起着重要作用，控制血管新生，将减少关节损伤、控制症状及延缓疾病进展。相信随着研究进展，将对血管新生的调节机制有着更进一步以及更确切的发现，而这些发现，如同血管生成因子一样，能为新治疗提供潜在靶点，为新的诊断方法提供生物标志，从而更早期的发现、治疗骨性关节炎等关节病变。

[1]Shek Man Chim,Jennifer Tickner,Siu To Chow,et al.Angiogenic factors in bone local environment[J].Cytokine&Growth Factor Reviews,2013,24(3):297-310.

[2]Loeser RF,Goldring SR,Scanzello CR,et al.Osteoarthritis:a disease of the joint as an organ[J].Arthritis Rheum,2012,64(6): 1697-707.

[3]陈杰，李甘地，主编.病理学[M].第二版，北京:人民卫生出版社，2011，6:48-49.

[4]王庆昱.髁突骨软骨交界血管新生在颞下颌关节骨关节病的研究[D].第四军医大学，2012.

[5]Yuan X L,Meng H Y,Wang Y C,et al.Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis:potential pathways and future therapeutic strategies[J].Osteoarthritis and Cartilage,2014,22(8): 1077-1089.

[6]Mahjoub M,Berenbaum F,Houard X.Why subchondral bone inosteoarthritis?The importance of the cartilage bone interface in osteoarthritis[J].Osteoporos Int,2012,23(8):841-846.

[7]Mapp PI,Walsh DA.Mechanisms and targets of angiogenesis and nerve growth in osteoarthritis[J].Nature Reviews Rheumatology, 2012,8(7):390-398.

[8]Sunita Suri,David A.Walsh.Osteochondral alterations in osteoarthritis[J].Bone,2012,51(2):204-211.

[9]Steadman JR,Rodkey WG,Briggs KK,et al.Rehabilitation FollowingMicrofracture forChondral Injury in theKnee[J].Clinics in Sports Medicine,2010,29(2):257-265.

[10]C.Mathieu,A.Chevrier,V.Lascau-Comam,et al.Stereological analysis of subchondral angiogenesis induced by chitosan and coagulation factors in microdrilled articular cartilage defects[J].Osteoarthritis and Cartilage,2013,21(6):849-859.

[11]Laurence Pesesse,Christelle Sanchez,Yves Henrotin.Osteochondral plate angiogenesis:A new treatment target inosteoarthritis[J]. Joint Bone Spine,2011,78(2):144-149.

[12]袁雪凌，汪爱媛，孟昊业，等.兔膝骨关节炎进程中软骨下骨血管生成的实验研究[J].中华关节外科杂志（电子版），2013，7（6）:810-814.

[13]David A.Walsh,Dan F.McWilliams,Matthew J.Turley,et al.Angiogenesis and nerve growth factor at the osteochondral junction in rheumatoid arthritis and osteoarthritis[J].Rheumatology,2010,49 (10):1852-1861.

[14]Mabey T,Honsawek S,Saetan N,et al.Angiogenic cytokine expression profiles in plasma and synovial fluid of primary knee osteoarthritis[J].Int Orthop,2014,38(9):1885-1892.

[15]Muller YA,Christinger HW,Keyt BA,et a1.The crystal structure of vascular endothelial growth factor(VEGF)refined to 1.93 resolution:mutiple copy Flexibility and receptor binding[J].Structure, 1997,5(10):1325-1338.

[16]Papetti M,Herman IM.Mechanisms of normal and tumor-derived angiogenesis[J].Am J Physiol Cell Physiol,2002,51(5):947.

[17]Advalli A.Vascular endothelialgrowth factorandthe kidney:something of the marvelous[J].Curr Opin Nephrol lypertens,2014,23 (1):87-92.

[18]Sun-Hee Heo,Young-Jin Choi,Hyun-Mo Ryoo,et al.Expression profiling of ETS and MMP factors in VEGF-activated endothelial cells:role of MMP-10 in VEGF-induced angiogenesis[J].Journal of Cellular Physiology,2010,224(3):734-742.

[19]Juffer P,Jaspers RT,Lips P,et al.Expression of muscle anabolic and metabolic factors in mechanically loaded MLO-Y4 osteocytes [J].American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism,2012,302(4):389-395.

[20]Yamairi F,Ltsumi H,OnoY,et al.Expression of vascular endothe1ial growth factor（VEGF）associated with histopathological changes in rodent models of osteoarthritis[J].J Toxicol Pathol, 20ll,24(2):137-142.

[21]Cheung WY,Liu C,Tonelli-Zasarsky RM,et al.Osteocyte apoptosis is mechanically regulated and induces angiogenesis in vitro [J].Journal of Orthopaedic Research,2011,29(4):523-530.

[22]郭静，张娜，秦丽娟，等.膝骨关节炎患者中IL-18、VEGF和NFB的表达及意义[J].实用医学杂志，2013，29（18）:3024-3026.

[23]刘秀丽，滕蔚然，金立伦.血管内皮生长因子在骨关节炎中的研究进展[J].医学综述，2014，20（17）:3092-3094.

[24]Lin YM,Huang YL,Fong YC,et al.Hepatocyte growth factor increases vascular endothelial growth factor-A production in human synovial fibroblasts through c-Met receptor pathway[J].Plos One, 2012,7(11):50924.

[25]Walsh DA,Bonnet CS,Tumer EL,et al.Angiogenesis in the synovium and at the osteochondral junction in osteoarthritis[J].Osteoarthritis Cartilage,2007,15(7):743-751.

[26]韩金祥主编.骨分子生物学[M].北京:科学出版社，2010，8：238-241.

[27]Chim SM,Qin A,Tickner J,et al.EGFL6 promotes endothelial cell migration and angiogenesis through the activation of extracellular signal-regulated kinase[J].Journal of Biological Chemistry,2011, 286(25):22035-22046.

[28]Bertrand-Duchesne MP,Grenier D,Gagnon G.Epidermal growth factor released fromplatelet-rich plasma promotes endothelial cell proliferation in vitro[J].Journal of Periodontal Research,2010,45 (1):87-93.

[29]Mehta VB,Zhou Y,Radulescu A,et al.HB-EGF stimulates eNOS expression and nitric oxide production and promotes eNOS dependent angiogenesis[J].Growth Factors,2008,26(6):301-315.

[30]成军主编.现代细胞外基质分子生物学[M].北京:科学出版社，2012，6:334-343.

[31]Tomohiro Kato,Shigeru Miyaki,Hiroyuki Ishitobi,et al.Exosomes from IL-1 stimulated synovial fibroblasts induce osteoarthritic changes in articular chondrocytes[J].Arthritis Research&Therapy,2014,16(4):163.

[32]Blom AB,Brockbank SM,van Lent PL,et al.Involvement of the Wnt signaling pathway in experimental and human osteoarthritis: prominent role of Wnt-induced signaling protein 1[J].Arthritis Rheum,2009,60(2):501-512.

[33]Semenza GL,Nejfelt MK,Chi SM,et a1.Hypoxia-inducible nuclear factors bind to an enhancer element located 3'to the human erythropoietin gene[J].Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(13): 5680-5684.

[34]Husa M,Liu-Bryan R,Terkeltaub R.Shifting HIFs in osteoarthritis [J].Nat Med,2010,16(6):641-644.

[35]Perrotta I,Moraca FM,Sciangula A,et al.HIF-1 and VEGF:Immunohistochemical Profile and Possible Function in Human Aortic Valve Stenosis[J].Ultrastructural Pathology,2015,39(3): 198-206.

[36]Henna Niemi,Krista Honkonen,Petra Korpisalo,et al.HIF-1a and HIF-2a induce angiogenesis and improve muscle energy recovery [J].European Journal of Clinical Investigation,2014,44(10): 989-999.

[37]Trebec-Reynolds DP,Voronov I,Heersche JN,et al.VEGF-A expression in osteoclasts is regulated by NF-kappaB induction of HIF-1alpha[J].Journal of Cellular Biochemistry,2010,110(2): 343-351.

[38]EA Stewart,WM Amoaku.The functional effects and expression of HGF and FGF in the choroid[J].Acta Ophthalmologica,2014,92 (253):0.

[39]Toshihiro Nagai,Masato Sato,Miyuki Kobayashi,et al.Bevacizumab,an anti-vascular endothelial growth factor antibody,inhibits osteoarthritis[J].Arthritis Research&Therapy,2014,16(5):427. [40]Kadri A,Funck-Brentano T,Lin H,et al.Inhibition of bone resorption blunts osteoarthritis in mice with high bone remodeling[J]. Annals of the Rheumatic Diseases,2010,69(8):1533-1538.

[41]Pengfei Hu,Weiping Chen,Jiapeng Bao,et al.Cordycepin modulates inflammatory and catabolic gene expression in interleukin-1beta-induced human chondrocytes from advanced-stage osteoarthritis:an in vitro study[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(10): 6575-6584.

The research advancement of angiogenesis in articular subchondral bone

Xu Xun,Ma Jin Zhong.
Department of Orthopaedics,Shanghai General Hospital,Shanghai,201620,China

Osteoarthropathy is avery commomdisease.Thepainanddysfunctionitleads tohavea greatimpactonhuman health and quality of life.But the aetiological agent and pathomechanism of osteoarthropathy are not entirely understood. In recent years,the change of subchondral bone and angiogenesis have been taken seriously.This article will summarize the relationship between osteoarthropathy and angiogenesis in subchondral bone,as well as it's research advancement.

Subchondral bone;Angiogenesis;Bone-cartilage interface;Proangiogenic factors

R684

B

10.3969/j.issn.1672-5972.2016.03.019

swgk2015-11-00225

徐汛（1991年-）男，硕士研究生在读。研究方向:关节、骨病。

*[通讯作者]马金忠（1963-），男，博士，主任医师。研究方向：骨与关节疾病，运动医学。

2015-11-17）

上海市第一人民医院，上海201620