脊髓损伤机制及骨髓间充质干细胞移植治疗机制的研究*

杨新明 胡长波 成垚昱

脊髓损伤机制及骨髓间充质干细胞移植治疗机制的研究*

杨新明 胡长波 成垚昱

脊髓损伤（SCI）机制分为初级阶段和次级阶段。初级阶段是不可逆转的原发机械性损伤过程，次级阶段是可逆且可控制的继发性损伤引发的炎症反应、脂质过氧化反应、细胞凋亡等生物化学反应过程；骨髓间充质干细胞移植可以对SCI进行干预治疗，其治疗机制主要为减轻SCI区炎症反应，抑制氧化应激，分泌神经营养因子，分化成神经元和胶质细胞，促进轴突再生及髓鞘重新形成。SCI机制的发生是一系列多元化生物化学反应，骨髓间充质干细胞移植对其治疗具有良好的应用前景，其机制亦是多因素协同作用的结果，但具体机制仍需要进一步深入研究。

脊髓损伤；损伤机制；骨髓间充质干细胞；治疗机制

脊髓损伤 (Spinal cord injury,SCI)是脊柱受到外力作用致受损脊髓平面以下感觉、运动、大小便功能障碍为主要临床表现的中枢神经系统创伤病变。由于SCI致残率高，临床疗效差，并发症较多，已成为国内外学者共同关注的重大课题。目前对SCI患者脊神经的器质性病变临床上缺乏有效的治疗方法。随着医学发展，干细胞移植技术治疗SCI具有良好的应用前景，目前受最受青睐的是骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchynalstemcells,BMSCs)，其比其他干细胞优越性在于取材方便、来源较多、可自体移植、可塑性好、增殖力强、低免疫原性生物特性，且能在宿主内中长期存活等诸多优点[1]。本文现就BMSCs移植治疗SCI机制的潜在能力及现阶段研究成果进行综述。

1 SCI机制

SCI机制分为初级阶段和次级阶段。初级阶段为原发性机械性外力致神经元及神经胶质损伤，引发细胞破坏死亡不可逆转的病理生理反应过程。次级阶段为继发性损伤后级联分子和细胞活动引发的可逆转且可控制的一系列生物化学反应过程[2]。这种生物化学反应主要有微循环缺血、炎症反应、脂质过氧化反应、离子通道连续性中断、轴索脱髓鞘、坏死、神经胶质瘢痕形成和细胞凋亡等病理生理过程，可持续数周或数月乃至数年[3]。SCI恢复主要困难归结于神经轴突的再生，这些病理变化很大程度上加重了原始的损伤并且创造出一种阻碍了髓鞘再生微环境[4]，而受损组织的微环境中含有大量炎症细胞，微循环缺血、炎症反应使得脊髓营养障碍，神经胶质细胞和神经元细胞失去营养支持导致死亡，引起脊髓囊腔及神经胶质瘢痕的形成[5]。而炎症反应、脂质过氧化反应、细胞凋亡在继发性损伤中起着重要作用。

1.1 炎症反应

介导 SCI后炎症反应发生过程是除中性粒细胞参与之外，还有比较重要的肿瘤坏死因子-a(TumorNecrosisFactoralpha,TNF-a)、白细胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)、白细胞介素-8(Interleukin-1,IL-8)和巨噬细胞参与。

TNF-a不仅是重要的炎症介质还是致病因子，特别在SCI次级阶段的继发性损伤炎症反应中扮演重要角色[6]。TNF-a也是诸多其他重要细胞因子的启动因子，而且还可上调相关细胞因子的产生，并在脊髓缺血后的白细胞浸润和组织损伤中同样起重要作用。研究表明，在缺血时中枢神经系统内除巨噬细胞、单核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和肥大细胞外，胶质细胞、神经元等均可产生和释放具有广泛生物学活性的TNF-a，后者可以增加中性粒细胞对内皮细胞的黏附力并使其激活，上调更多的细胞因子产生[7]。缺血再灌注时的反应性氧产物、免疫复合物等都促进TNF-a的产生。此外，TNF-a还是一种主要的外源性促凋亡信号，其与神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞的Fas受体结合，触发凋亡系列酶的激活，诱发凋亡的发生。

IL-1是一种单核因子，体内主要由活化的单核一巨噬细胞产生，而在SCI中，主要是来源于脊髓中的小胶质细胞，SCI后l小时内IL-1表达升高，信号通路TLR4-MyD88被IL-1受体激酶激活，从而使 TNF-a受体6出现表达，下游的TNF-a、转录因子NF-B、诱导IL-6、IL-12被继续激活导致促炎性因子的表达[8]。

IL-12在SCI炎症过程中具有趋化炎性细胞使其表面黏附分子表达升高，黏附更多的 T淋巴细胞、中性粒细胞和血管内皮细胞，引发膜破裂、溶酶体酶释放、呼吸爆发和细胞凋亡，从而又进一步激活其他相关细胞引发负面连锁反应导致炎症反应加剧；白细胞介素之间互相作用构成错综复杂网络，形成所谓的“瀑布效应”介导并激化了SCI后的炎症反应[9]。

巨噬细胞具有诱导一氧化氮 (Nitric Oxide,NO)酶和合成NO功能，后者破坏细胞内线粒体，导致细胞色素C释放，激活凋亡效应酶使细胞凋亡；在代谢过程中诸多细胞因子也产生一氧化氮自由基，最终亦导致细胞凋亡[10]。

1.2 脂质过氧化反应

脊髓初级阶段原发性损伤后氧自由基和脂质过氧化应激反应是导致脊髓次级阶段继发性损伤的主要发病机制，大量研究也表明抗氧化药物能明显改善SCI情况[11]。

脊髓组织中存在较多的不饱和脂肪酸，SCI后不能及时有效清除损伤产生的大量游离自由基，后者极易与脊髓组织中不饱和脂肪酸产生脂质过氧化反应，损害细胞膜和亚细胞膜的通透性，引发ATP生成、离子转运功能和膜容量调节障碍，导致更多自由基产生，而后者更加重与不饱和脂肪酸脂质过氧化反应使神经细胞最关键的呼吸链酶受损，引起DNA及其相关蛋白结构链改变和Na-KATP酶活性抑制，最终导致神经细胞变性、坏死。Sekhon等[12]学者认为，脊髓急性原发性损伤后5分钟即可产生脂质过氧化物，损伤后1小时达高峰，其最高值可以达到未损伤脊髓的3倍，随后峰值逐渐下降。

正常情况下机体细胞代谢产物自由基有高度活性，随时被诸多过氧化酶转化成H2O和O2或者被抗氧化剂清除。反之，SCI次级阶段由于内源性相关的过氧化酶减少和抗氧化剂的耗竭，因而无法及时将异常增多的自由基有效清除，后者诱导不可逆转的细胞凋亡，进一步引发细胞死亡[13]。内源性抗氧化剂和超氧化歧化酶对损伤缺血的脊髓组织具有保护作用，除自由基增多可造成损害外，无论是损伤区脊髓还是邻近未损伤的脊髓，继发性损伤与NO升高有关[14]。NO是存在于人体许多组织正常代谢中的一种特殊自由基，具有扩张血管、免疫活性和神经传递生理功能。当NO产生异常增多时结合氧自由基生成活性极高的过氧化亚硝酸盐基团，后者对蛋白质、脂质、DNA破坏力较强，诱发细胞凋亡[15]。另外，活性氧的大量释放不但激活补体且可以活化的相关补体片段，后者促血管内皮细胞表达黏附分子，被激活的中性粒细胞通过呼吸爆发又大量产生活性高的活性氧，使脂质二次受到过氧化反应损伤，即活性氧-活化补体片段-活化的中性粒细胞-过氧化反应-活性氧形成恶性循环损伤机制，导致炎症反应增强且免疫反应持续扩大[16]。实验研究发现，在对SCI大鼠使用清除自由基药物，能明显降低体内及脊髓组织中氧自由基浓度和升高超氧化歧化酶浓度。

1.3 细胞凋亡

Liu等[17]利用动物SCI模型发现，SCI与神经元和神经胶质细胞的细胞凋亡有关。Emery等[18]首先证实在人类创伤性SCI后存在细胞凋亡。Bardeesy等[19]学者实验观察，大鼠SCI 5分钟后未发现细胞凋亡，4小时后出现损伤处神经元凋亡，8小时细胞凋亡达高峰；7天后发现无论损伤区还是邻近损伤区几微米节段的脊髓白质亦出现胶质细胞凋亡，故SCI发生后灰质和白质细胞均可凋亡。少突胶质细胞是SCI后最易受微循环变化影响的细胞，更是凋亡细胞最常见类型。Caspase蛋白酶系列的“级联反应”是细胞凋亡最重要的启动因子和效应因子，也是最重要的 ICE样蛋白酶在细胞凋亡发生过程中发挥作用[20]。Caspase蛋白酶不仅可阻挡周围正常细胞与凋亡细胞的联系，抑制 DNA复制和RNA拼接，而且破坏重组细胞支架和细胞核结构，引发凋亡细胞释放吞噬信号，使细胞破溃、降解形成凋亡小体。Caspase-3蛋白酶在细胞凋亡多个途径中起重要效应作用，SCI时其活性显著增强，且脊髓灰质和白质细胞凋亡与其激活有关，SCI后Caspase-3的表达与神经细胞凋亡水平呈正相关，并参与SCI细胞凋亡的启动和调节[21]。

2 BMSCs治疗SCI的机制

SCI后损伤处灰质区神经细胞发生凋亡，白质区神经传导束脱髓鞘、断裂，神经正常功能缺失，由于神经元的不可再生性，损伤局部微环境发生变化使轴突再生受抑制，从而导致神经不可逆损伤其功能难以恢复。通过近几年国内外学者的动物实验和临床研究已肯定了干细胞移植在治疗SCI上的前景。2008年Fukuki Saito等[22]首次于人SCI的临床试验中应用BMSCs获得功能改善，研究表明BMSC治疗SCI作用机制是多方面的。

2.1 分化为神经元和胶质细胞

Woodbury等[23]于2000年首先报道了通过化学和生物诱导使BMSCs体外条件下分化为神经元。大量动物实验表明BMSCs在移植进入损伤模型后，可以迁移至病变坏死区域，填充囊性区，减少脊髓空洞面积，阻止胶质瘢痕的进一步扩大，并在局部微环境的作用下定向分化为胶质细胞及神经元细胞促进神经元轴突再生，重建局部神经回路，代偿了损伤细胞的功能，即认为是BMSCs发挥了“替代作用”[24,25]。但是诸多实验研究[26]发现，BMSCs移植后存活数量较少，并且替代的胶质细胞及神经元细胞有限，不足以完全替代受损的神经细胞而引起明显的功能恢复。

2.2 神经营养作用

BMSCs本身亦是一种支持细胞，能分泌多种生长因子，能对多种组织起支持作用。多数学者[27,28]研究发现BMSCs能表达神经营养因子的脑源性神经营养因子 (Brainderived neurotrophic factor,BDNF)和神经生长因子 (Nerve growth factor,NGF)的mRNA，产生BDNF和NGF。BDNF可以抑制局部炎症反应和细胞凋亡，在SCI中可促进神经元的存活和神经纤维的延长，阻止神经元胞体的萎缩，抑制且延长SCI后少突胶质细胞的凋亡。在修复SCI的过程中，迁移至损伤部位的BMSCs除直接影响并且调节损伤部位的微环境外，还能自身分泌或旁分泌血管内皮生长因子、NGF、BDNF等多种保护性神经营养因子[29]，而后者是神经系统中重要的调节蛋白，血管内皮生长因子表达上调，可以促进SCI部位微循环改善诱导微血管再生，而NGF、BDNF表达上调，可以促进神经再生，提高神经元存活率，介导轴突生长，增加突触的可塑性，激发产生和释放大量神经递质，为SCI修复方面发挥着重要的作用[30]。

2.3 抑制氧化应激、减轻炎症反应

BMSCs具有多种分化功能的干细胞，其本身即可分泌多种具有抗氧化能力的生长因子，还可以自身分化为血管平滑肌细胞和血管内皮细胞，直接生成新的血管为SCI缺血部位微循环建立提供新的血液和氧气供应，其作用抑制氧化应激，使细胞线粒体功能得以恢复[31]。BMSCs在抑制氧化应激的同时亦即减轻了损伤部位的炎症反应，另外BMSCs通过分泌相关的细胞因子和调节蛋白直接或间接下调脊髓组织中TLR4信号通路介导的炎症反应，从而减轻了脊髓继发性损害程度[32]。

2.4 轴突再生及髓鞘重新形成

大量研究证实，移植到SCI区域的BMSCs在特定理化条件下可以诱导分化为少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元，它们将修复和重建受损的神经通路，而少突胶质细胞对于脱髓鞘轴突重新髓鞘化具有重要作用[33,34]。此外，BMSCs分泌的细胞外基质和神经营养因子同样有助于轴突和髓鞘的再生[35]。研究发现[36]膜型基质金属蛋白酶亦是BMSCs分泌的且能够降解胶质瘢痕和消除物理屏障，在BMSCs迁移归巢和轴突再生过程中同样起重要作用。SCI主要的修复途径为损伤后残留的神经细胞以终末出芽方式再生，连接靶细胞，重建神经环路，而BMSCs产生大量丰富的神经营养物质如神经营养因子，为修复SCI提供后勤保障。

3 展望及面临解决的问题

BMSCs具有多分化潜能干细胞，易于分离培养，扩增能力强，体内移植反应弱，无免疫排斥，不存在伦理道德问题，并且来源广泛和取材容易方便，故在SCI治疗领域展现了其良好的应用前景。BMSCs治疗SCI动物实验和基础研究虽然取得较大进展，但是首次临床试验应用其治疗效果并不理想，修复损伤的脊髓功能恢复离期望值较远[37,38]。国内外学者面临进一步解决的问题：①SCI机制与BMSCs治疗其机制仍然需要深入研究；②BMSCs移植后存活率和分化为神经元的比例均不高，是初始修复SCI效果不理想而需要解决的主要原因；③有待于研发有如肌基膜管（类似于神经膜管的生物支架）、外源性或内源性神经营养因子、抗氧化应激药物等联合辅佐BMSCs移植进行多途径治疗SCI，以便提高临床疗效；④BMSCs虽然可以通过各种方法给予标记，但缺乏特异的表面标志给真正分化成神经元的原始BMSCs鉴定仍带来一定困难；⑤由于临床应用BMSCs移植治疗SCI开展较少，故此疗法对于修复SCI最终临床价值的评定有待于进一步研究。

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Spinal cord injury mechanism and mechanism of bone marrow mesenchymal stemcell transplantation therapy between research progress

Yang Xinming,Hu Changbo,Cheng Yaoli.
Department of Orthopedic,the First Affiliated Hospital of HeBei North University,Zhangjiakou Hebei,075000,China

Mechanism is divided into stages of primary and secondary spinalcordinjury.Primarystage is an irreversible process of primary mechanical damage,the secondary stage is reversible and controllable secondary injury caused by inflammation,lipidperoxidation,apoptosis andother biochemical reaction process;Between bonemarrowmesenchymal stem cell transplantation for spinal cord injury intervention treatment,its treatment mechanism is mainly to reduce area inflammation of spinal cord injury,inhibiting oxidative stress,secrete neurotrophic factors,differentiate into neurons andglial cells,topromoteaxonalregeneration and myelin formation.Diversified mechanisms of spinalcord injury(SCI) is a series of biochemical reactions,between bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for the treatment has a good application prospect,its mechanism is also the result of the multi-factor synergism,but the specific mechanism still needs further research.

Spinal cord injury;Damage mechanism;Bone marrow mesenchymal stem cells;Treatment mechanism

R744

B

10.3969/j.issn.1672-5972.2016.06.18

swgk2016-06-00150

杨新明（1963-）男，硕士生导师，主任医师。研究方向：关节脊柱外科。

2016-06-29)

河北省卫生厅二〇一一年医学科学研究重点项目计划（20110176）；2013年度河北北方学院创新人才培育基金项目（CXRC1322），

河北北方学院附属第一医院骨科，河北张家口075000