T细胞免疫干预治疗1型糖尿病

刘尧娟，王贯乔，王树森，2，3（.卫生部危重病急救医院重点实验室，天津30000；2.天津市第一中心医院移植中心，天津 30092；3.天津市器官移植重点实验室，天津 30092）

1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是一种器官特异性的免疫性疾病，近年来，发病率在全球范围内尤其是儿童中处于上升趋势。T1DM可能是由于特殊致病基因的改变，一种或多种环境因素导致，但具体病因仍不能确定。大量研究显示，T1DM主要发病机制是自身免疫性T细胞攻击释放胰岛素的β细胞［1］。T1DM患者依赖于外源性胰岛素治疗，但常发生严重的低血糖或胰岛素剂量不足而导致的高血糖，疾病后期常发生严重并发症（微血管和大血管疾病）甚至死亡［2］。

由于T1DM多出现于儿童早期，所以疾病带来的痛苦将伴随患者终身，同时为个人、家庭和社会带来严重的经济负担。临床资料显示，糖尿病患者糖化血红蛋白（hemoglobin A1c，HbAlc）小于7.0%时可减少微血管和大血管疾病的发生，但大量临床调查发现，仅13%～15%的患者能够达到这个目标［3］。近年来，尽管在胰岛素种类、动态血糖监测、胰岛素泵等方面取得了重大进步，再加上严格的代谢控制、规范的血糖控制（HbAlc＜6.9%），T1DM患者的病死率仍是对照组的2倍［2，4］。这些研究结果提示我们，应在患者高血糖发生之前对其进行个体化干预或对T1DM初发病患者的剩余胰岛细胞进行保护，更进一步，则是通过移植匹配的同种异体胰岛、自体干细胞分化及刺激β细胞体外增殖等方法，使一些体内有很少或几乎没有功能性胰岛的T1DM患者的β细胞功能得到修复［5］。但要长期保存T1DM患者的胰岛功能，还需要通过各种免疫干预方式来抑制其自身免疫反应。

1 免疫病理

T1DM是一个自身免疫过程［6］∶人白细胞抗原易感基因可能导致主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）多肽与自身T细胞受体（T cell receptor，TCR）结合力改变，引起自身反应性T细胞从胸腺逃逸，即无法获得中枢耐受，导致自身免疫反应的发生，从而引发T1DM［7］。然而在健康对照组外周血中仍然可以发现自身反应性T细胞，表明T1DM还存在其他发病机制［7］。T1DM的自身免疫过程受遗传和环境因素影响［6］，其中外周免疫耐受缺陷是导致此过程的重要因素。外周免疫耐受缺陷由许多原因导致的，包括与T1DM相关的编码白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-2受体的α亚基、CTLA4和转录因子FoxP3基因。Coppieters等［8］研究发现，机体外周免疫耐受监测点的某些基因缺陷导致自身反应性T细胞活化，使胰岛受到免疫性攻击，出现T1DM的特征性病变胰岛素炎，诱发T1DM。

2 免疫干预靶点

随着T1DM的免疫病因学逐渐明确，研究者采用了一些非特异性免疫抑制剂，包括环孢素、咪唑硫嘌呤和泼尼松等来治疗T1DM，尽管有一定的疗效，但由于免疫抑制伴随的严重不良反应致使这些临床试验被终止［9］。中枢及外周的免疫耐受缺陷导致自身免疫反应的出现，T细胞（CD4+和CD8+）被激活，破坏大量胰岛β细胞，使T细胞成为免疫干预的重要靶点。在T1DM中效应T细胞（effector T cell，Teff）通过抑制调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）的功能导致β细胞凋亡。另外，除了常规的T细胞外，抗原提呈细胞（antigen presenting cells，APCs），包括B细胞、单核/巨噬细胞和树突细胞及T1DM免疫病理学相关的可溶性介质，也可成为潜在的免疫干预靶点。随着对免疫疾病的深入研究和治疗方法的巨大进步，尤其是靶向T细胞、B细胞及各种细胞因子表面受体的融合蛋白及单克隆抗体的出现，使靶向免疫干预治疗T1DM成为可能。本文将着重介绍与T细胞相关的已经应用于临床或可能应用于临床的免疫干预方法。

3 针对T细胞的免疫干预治疗

3.1 共刺激分子阻断剂∶共刺激分子是T细胞与抗原首次接触后，再次被激活的重要信号，是连接固有免疫和获得免疫的桥梁。表达抗原肽-MHC复合物的APCs与相应的T细胞接触后，T细胞表面的TCR可同时识别MHC和结合于MHC分子沟槽里的抗原肽，从而提供T细胞活化的第一信号。然而T细胞激活还需要APCs表面的共刺激分子作为第二信号，如果没有共刺激分子，T细胞将不能活化甚至凋亡。经典通路的受体配体是由APCs表面的CD80/CD86（B7-1/B7-2）和天然CD4+和CD8+T细胞表面的CD28组成。T细胞被活化后，表面表达第2种CD80/CD86受体-CTLA4分子，其不同于CD28，具有抑制功能。由于多种共刺激和共抑制信号通路的发现，许多具有干预作用的药物问世［10-13］。针对共刺激通路开发的靶向药物CTLA4-Ig融合蛋白（阿贝西普）［14］，作为可溶性受体与CD80/CD86结合，阻断CD80/CD86-CD28共刺激信号通路，已被应用于治疗类风湿关节炎［15］。治疗初发T1DM的研究表明，阿贝西普治疗后，6个月内患者C肽分泌量正常，之后的2年内疗效较对照组无显著差异，另外，对外周T细胞亚群进行流式细胞学分析，其结果无明显变化，但发现大量初始CD4+T细胞增殖和中央记忆CD4+T细胞减少，这同C肽分泌量的结果相符［16-17］。与我们预想的一致，尽管反应速度比预期慢，但从治疗开始，一些主要调节C肽反应的Treg数量出现减少趋势，然而Treg控制APCs的功能是通过其细胞表面CTLA4调控的这个机制并没有在本实验中得到验证。尽管如此，阿贝西普通过阻断共刺激通路治疗T1DM这一思路是可行的，并有待进行深入研究。同时，阿贝西普用于预防T1DM高危人群的试验目前也在进行中。

3.2 特异性抗原治疗∶针对免疫耐受治疗更有意义的是抗原特异性治疗。具体的方案是在自身免疫疾病中对特异性致病抗原（自身抗原）进行有针对性的特异性治疗［18］。如果自身抗原出现在耐受性的环境中，与耐受性的APCs结合或结合相应的共抑制信号，使得自身反应性Teff下调并且伴随着抗原特异性Treg上调。由于不需要广泛的免疫抑制，并且可以反复进行治疗，因此，这种治疗方案得到了更多研究者的认可。

尽管经过几十年来不断努力，但免疫干预治疗的进展并不理想，在一些治疗方式中甚至出现患者病情加重的现象［19］。目前，治疗所面临的障碍包括∶治疗药物剂量、临床路径、诱导剂、给药途径及给药频率。由于在T1DM中特异性抗原治疗缺乏规范，近年来治疗效果不佳［20］。然而最近一项关于DNA质粒编码胰岛素原的初期研究结果显示，在1～4次剂量治疗中，15周内C肽的分泌量没有变化，此后C肽的分泌量较对照组无显著差异，且发现C肽的数量保留与胰岛内特异性CD8+T细胞浸润减少有很大相关性［21］。尽管这次因实验样本过少无法得出令人信服的结论，但此结论却给我们很大的提示∶如果在T1DM治疗中给予合适的剂量，可能会得到令人满意的结果。特异性抗原治疗还包括联合其他药物治疗需要完成［22］。

3.3 T细胞耗竭∶早期免疫干预治疗中，用抗胸腺细胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）联合激素治疗初诊断的T1DM，在改善患者HbAlc水平和减少胰岛素用量方面取得了很好的疗效［23］，但经过12个月的研究发现，与对照组相比，ATG治疗组并未出现显著的治疗效果，并且研究数据显示ATG治疗组C肽分泌量前6个月较后6个月有加速减少的迹象［24］。在干预治疗过程中发现，所有研究对象在给药7～10天后释放细胞因子，血清中短暂出现大量IL-6和急性蛋白反应，表明存在负向免疫调节。另有研究表明，进一步免疫活化是T1DM恶化的机制，需通过IL-2联合雷帕霉素进行治疗［25］。

3.4 T细胞调节∶在T1DM或大多数自身免疫性疾病中，为了尽量保持Treg和Teff的平衡，一种方法是耗竭相关自身反应性Teff；另一种方法是通过调节Teff，使其处于低反应状态，如提高T细胞的无效性、耗竭或早衰［26］。通过阻断共刺激通路导致T细胞无效反应也是一种干预手段。合理有效的干预应该是耗竭Teff或使其无反应性与增强Treg的功能有效结合［22］。

在初诊断的T1DM中，可通过T细胞进行靶向治疗，CD3单克隆抗体即TCR复合物的一部分来维持C肽的分泌。Herold等［27］在初发病的T1DM患者中应用Fc无链受体hOKT3γ1（Ala-Ala）抗CD3抗体（后来命名为teplizumab），发现其具有保护C肽功能、降低HbAlc水平和胰岛素用量的作用。该研究结论同样被一个欧洲团队用另一种抗CD3抗体（otelixizumab）证实［28］。这 2个团队的研究结果均表明，CD3抗体在部分患者中的治疗效果可以维持3年以上［29-30］。然而相当一部分接受此种治疗方式的患者在服药期间出现细胞因子释放综合征和EB病毒活化或EB病毒相关的疾病［31］，随后大量实验都以失败告终，部分原因是选择剂量过低［32-33］。这些结果令人惋惜但也为免疫干扰的进一步研究提供了必要线索。

在Teplizumab的2期临床试验中，接受第2次药物治疗12个月后，与对照组相比，实验组患者的C肽分泌维持了24个月，这可能是由于抗体阻断自身免疫从而诱导早期T1DM耐受，即部分治疗有效的患者C肽能够得到非常好的保护，而治疗无效的患者则观察不到任何变化［34］。然而Teplizumab的基础药物反应和活性机制尚不清楚。在早年的研究中，特别是在非肥胖糖尿病动物模型中发现，CD3抗体治疗可以选择性耗竭致病性T细胞同时保护Treg，但这一机制并没有在人类研究中得到验证［35］。研究发现，治疗有效的患者CD4+/CD8+T细胞比值下降［27，29］，与最近发现的延期治疗患者（非初发病的T1DM患者）中央记忆性CD8+T细胞升高的结果一致［36］。尽管CD8+T细胞总数增加与预期不符，但这可能暗示抗CD3有部分激动效应，诱导不同类型Teff的调控。

最近，另一种治疗初发T1DM的T细胞调节药物阿法赛特正在评估。阿法赛特是一种针对T细胞的靶向CD2共刺激通路的LFA3-Ig融合蛋白。CD2在大部分淋巴细胞表面表达，但在Teff和记忆性T细胞表面不表达。早期关于银屑病的研究发现，阿法赛特能够选择性的靶向作用于效应性记忆T细胞，其机制可能与T细胞亚群部分耗竭，调控CD2介导的共刺激通路有关［37］。在银屑病的治疗中，2次或多次使用阿法赛特治疗后病情能够得到长期缓解，这可能是免疫耐受的一种形式［38］。初发病的T1DM用阿法赛特进行了2次12周的疗程，发现C肽保留、胰岛素用量显著下降，且与对照组相比，12个月内严重低血糖的发生率降低了50%，这提示对于初发病的T1DM患者来说，应用阿法赛特治疗可缓解病情［39］。

通过流式细胞术对阿法赛特治疗组的T细胞亚群分析发现，中央和效应性记忆CD4+和CD8+T细胞显著减少，Treg得到保存，Treg/Teff比值显著升高，临床疗效明显。值得关注的是阿法赛特诱导T细胞改变的现象，包括降低T细胞的无反应性和/或部分兴奋作用，这些都已经在人外周血单核细胞（peripheral blood monouclear，PBMC）［40］的体外试验中得到证实。由于没有发生哺乳动物相关的严重不良事件，阿法赛特可能是一种合适作用于T1DM患者甚至儿童患者的干扰免疫调节治疗药物［39］。

3.5 Treg的增殖∶早期报道表明，可通过减少Teff或增加Treg来改善自身免疫疾病中的免疫平衡。雷帕霉素联合IL-2治疗初发病T1DM的预实验发现，实验组外周Treg数量和pSTAT5信号表达水平显著高于正常对照组［25］。然而，即使存在这些显著的变化，研究结果还发现可能由于外周自然杀伤细胞和嗜酸粒细胞的大量增多和其他形式的免疫活化导致病情迅速恶化（C肽急剧下降）［25］。雷帕霉素在抑制Teff活性的同时，可能对β细胞具有毒害作用或在某些环境下出现抗耐受性。同时低剂量IL-2治疗T1DM的实验还在进行［41-42］，需探索出不仅能够使Treg增殖还能够抑制Teff活化的应用剂量。

另一种增加Treg的方法是通过移植自体扩增Treg。近年来，这种方法已受到广泛关注，并且正在应用于T1DM的治疗中［43］。最近报道表明，初发病的T1DM患者输注自体Treg，部分患者C肽保留超过1年［44-45］，但现阶段此干预方式的有效性和安全性仍不能肯定。目前，人们更关心的是Treg的稳定性和可塑性［46］及在自身免疫环境中Treg向Teff致病性转化的潜能［47］。为保证Treg输注后的稳定性，必须同时服用IL-2以提高其稳定性和抑制功能。

4 总 结

通过对相关研究的总结和分析，我们已经对T1DM的免疫机制有了深刻的了解，也更详细的了解了通过T1DM免疫机制进行的免疫干预疗法，包括免疫干预的靶向识别、非特异性免疫抑制药物的临床研究、靶向生物制剂甚至细胞治疗的研发和应用等，其中一些干预有潜力应用于临床治疗中。应更加强调根据机制进行免疫耐受的药物联合应用，同时β细胞在T1DM中的作用也需要受到重视。

不同于干细胞或者药物诱导细胞再生，一旦免疫耐受被重新恢复，长期保留剩余的β细胞或保持移植后β细胞接近正常水平将可以实现。鉴于以上诸多原因，进一步优化免疫干预方式将成为今后T1DM免疫治疗研究的重点。