基于斑马鱼行为变化的水体突发汞污染生物预警技术研究

逯南南，孙韶华，宋武昌，杜娟娟，贾瑞宝

(1．山东省城市供排水水质监测中心，山东济南250021;2．山东建筑大学市政与环境工程学院，山东济南250101)

基于斑马鱼行为变化的水体突发汞污染生物预警技术研究

逯南南1，孙韶华1，宋武昌1，杜娟娟2，贾瑞宝1

(1．山东省城市供排水水质监测中心，山东济南250021;2．山东建筑大学市政与环境工程学院，山东济南250101)

针对突发水污染事件难以准确预警的现状，通过模拟水体突发汞污染事件，开展了以生物鱼行为变化为基础的水质生物预警技术研究。以正常水体中斑马鱼的行为变化为基础，采用高速摄像跟踪技术，解析了突发汞污染(0．1 mg/L)水体中斑马鱼游动行为(游动速度、高度、转弯次数、加速度)和通讯行为(平均距离、分散度)等行为指标的变化，结果表明:综合评价指标水质健康指数6 h内无法预警，以游动高度作为水体突发汞污染事件的监测预警指标，可将预警时间缩短至3 h。

汞;突发水污染;斑马鱼;行为变化;生物预警技术

近年来水体突发污染事故频发，严重威胁饮用水安全。传统的实验室检测因监测频率低、耗时长等问题难以满足水质预警要求，而水质在线监测技术目前已被广泛应用于水源地、河流、污水处理厂等水质的监测，其中基于水体中污染物暴露下鱼的行为变化的在线生物监测技术是进行水质预警的一种有效手段［1-3］。Belding等首次利用对鱼的呼吸行为的监测实现了水中污染物的预警，之后对鱼的运动行为(游泳速度、综合行为强度等)、逃避行为(浮头行动、急速游动等)、通讯行为(平均距离、分散度等)等指标的监测被应用于水质的在线预警［4-6］。

汞是我国《重金属污染综合防治“十二五”规划》中重点防控的重金属之一，可以通过多种途径进入人体引起神经毒性、肾脏毒性、生殖毒性、免疫毒性和胚胎发育毒性等多系统损伤。历史上曾发生过多次水体汞污染突发事件，如20世纪50年代日本熊本县的“水俣病”事件引发上百人死亡;20世纪80年代，由于化工企业含汞废水偷排，我国松花江一些江段汞含量大幅超标;我国锦州湾五里河也曾发生严重的水体汞污染，河水汞含量超标最高达400余倍［7］。汞及其化合物的环境行为以及其引发的生态环境和健康问题，一直备受人们的广泛关注，大量的调查研究表明，国内一些主要的河流、湖泊存在不同程度的汞污染［8-10］。因此，开展水体中突发汞污染生物预警技术研究，实现对突发污染事件的早期预报，可缩短应急响应时间，保障饮用水安全。

本文采用斑马鱼作为受试鱼种，以无机汞为污染物，利用高速摄像跟踪技术，通过对鱼群游动行为和通讯行为等多项行为指标的实时监测，考察污染物对斑马鱼行为的毒性效应和该技术对汞突发水污染的预警效果，为基于鱼类行为学的生物预警技术在水质突发污染事件中的应用提供基础数据和分析方法。

1 材料与方法

1．1 试验材料

试验中所用斑马鱼购自国家斑马鱼资源中心(China Zebrafish Resource Center)，本实验室饲养繁殖，养殖水温为25℃ ±1℃，pH值为7．2～7．6，使用增氧泵持续曝气，保证充足的溶解氧(近饱和水平)，光照黑暗比为10 h∶14 h，每天投喂1次，试验前24 h不喂食，选取体长3 cm±0．2 cm的鱼进行试验。

试验中所用药品均为色谱纯及以上。

1．2 试验方法

1．2．1 斑马鱼急性毒性试验

按照《水质 物质对淡水鱼(斑马鱼)急性致死毒性的测定》(GB/T 13267—91)中的要求进行斑马鱼急性毒性试验。

1．2．2 汞污染水体斑马鱼行为变化监测

采用流水式试验(流速为2 L/h)开展汞污染水体斑马鱼行为变化的研究。以氯化汞配制汞污染水体(浓度以Hg2+计)，养殖用水为对照组，使用水质毒性生物监测仪(由深圳水务集团开天源自动化工程有限公司生产)对斑马鱼行为变化进行监测，该监测系统示意图见图1。5条监测用斑马鱼被置于尺寸为400 mm×75 mm×300 mm(长×宽×高)长方体测试箱内(材质为亚克力)，前置的CCD摄像实时跟踪记录每条鱼的行为变化，并通过运动行为解析软件计算斑马鱼的运动行为参数(游动速度、高度、转弯次数、加速度)和通讯行为参数(平均距离、分散度)［11］。为避免生物钟对斑马鱼行为的影响，所有批次试验进行时间均为上午9:00至下午3:00，同时通过温控装置保持进水温度恒定，排除水温对斑马鱼行为的影响。

图1 斑马鱼行为监测系统示意图Fig．1 Experimental setup for behavioral measurement of zebrafish

1．2．3 数据分析

本文利用统计软件SPSS21．0进行Probit模型线性回归，计算得出各个作用时间下污染物对斑马鱼的半致死率LC50和95%的置信区间，并采用单因素方差分析法进行试验组间数据的差异显著性检验。

2 结果与讨论

2．1 斑马鱼急性毒性试验

通过斑马鱼的急性毒性试验，获取了Hg2+对斑马鱼不同暴露时间的半致死浓度(LC50)及其95%置信区间，见表1。由表1可见，试验结果与黄毅、汪红军等的研究结果相似，其中黄毅［12］发现Hg2+对斑马鱼的LC50-24h为0．20 mg/L，汪红军等［13］研究表明Hg2+对斑马鱼的LC50-96h为0．14 mg/L，而本试验Hg2+对斑马鱼的LC50-48h为0．19 mg/L。本文定义LC50-48h为1个毒性单位(1 TU)，并选取亚致死浓度剂量0．1 mg/L(国标限值的100倍，约0．5TU)进行后续的汞突发污染的模拟试验。

表1 斑马鱼不同暴露时间的半致死浓度(LC50)及其95%置信区间Table 1 Hg2+concentrations causing 50%(LC50)of mortality on the tested zebrafish population after different time exposures with corresponding 95%confidence limits

2．2 汞污染水体斑马鱼行为变化

2．2．1 综合评价指标

水质健康指数是由多项行为参数的监测数据计算得到的用于水质安全判定的一项综合评价指标，其取值范围为0～100，水质健康指数为60以上时表示水质正常，低于60时监测系统则报警。本试验得到0．1 mg/L的汞污染水体中斑马鱼连续暴露6 h，其水质健康指数的变化情况见图2。由图2可见，根据监测系统推荐的报警限值，本试验在0．1 mg/L的汞污染水体中斑马鱼连续暴露6 h，其水质健康指数与对照组相比变化不大，未发生报警。因此，需要对单项行为指标进行分析，以期找到对汞敏感性高的指标，从而缩短对突发事件的报警时间。

图2 汞污染水体中水质健康指数的变化Fig．2 Changes of water quality index in Hg2+polluted waterbody

2．2．2 斑马鱼游动行为指标

图3 汞污染水体中斑马鱼运动行为的变化Fig．3 Swimming activity changes of zebrafish under Hg2+exposure

表2 斑马鱼游动行为指标的差异性分析Table 2 Summary of statistical comparisons with behavioral endpoints under Hg2+exposure

正常水体中斑马鱼的游动速度、高度、转弯次数、加速度保持相对稳定，本试验得到0．1 mg/L的汞污染水体中斑马鱼连续暴露6 h，其运动行为的变化情况见图3和表2。由图3和表2可见，本试验在0．1 mg/L的汞污染胁迫下，斑马鱼的游动速度经历了一个先增大后恢复再减小的过程，表现出明显的行为调节反应。暴露后短时间内斑马鱼的游动速度增大，第1个小时内试验组游动速度平均值为41．00 mm/s，高于对照组的38．07 mm/s，此为水生生物对环境压力所表现的“回避行为”，是鱼类感知到污染物后的第一反应，其表现形式和维持时间长短受污染物的种类及浓度的影响，“回避行为”也被应用于水质监测和预警［14］;在暴露后的第2个小时，试验组斑马鱼的游动速度与对照组相差不大，从第3个小时开始试验组斑马鱼的游动速度逐渐减小，至暴露后的第5个小时试验组斑马鱼的游动速度显著低于对照组［见图(a)和表2］。在Hg2+污染水体中，斑马鱼更倾向于在水箱顶部游动，游动高度在持续暴露下有明显增大的趋势，整个试验中，对照组斑马鱼的每小时平均游动高度在94．96～132．62 mm之间，试验组斑马鱼从暴露后的第3个小时开始，游动高度增大到250 mm以上，与对照组相比差异显著［见图3(b)和表2］;斑马鱼转弯次数的变化与游动速度基本保持一致，只是试验组与对照组斑马鱼的统计学差异出现在暴露后的第6个小时［见图3(c)和表2］;而两组鱼的加速度变化无明显的规律性［见图3(d)和表2］，因此在后续的统计学分析中不再考虑此项指标。

2．2．3 斑马鱼通讯行为指标

Chew等［15］研究表明，正常水体中鱼群的运动轨迹分布整齐且有规律，当环境改变时，鱼群分布会发生变化，可作为监测外界环境压力的有效指标。汞污染水体暴露中，斑马鱼感知到污染物存在后会有短暂的集群反应，鱼之间的平均距离和分散度有明显减小的现象。本试验得到0．1 mg/L的汞污染水体中斑马鱼连续暴露6 h，其通讯行为的变化情况见图4。由图4可见，在暴露的前3 h，试验组斑马鱼的平均距离和分散度与对照组相比显著减小，3 h后逐渐恢复，与对照组相比无显著性差异。

图4 汞污染水体中斑马鱼通讯行为的变化Fig．4 Communication patterns of zebrafish under Hg2+exposure

3 结论与展望

(1)汞突发污染水体中，斑马鱼的游动速度短时间内增大，至暴露后的第2个小时恢复到暴露前的水平，之后游动速度逐渐下降，整个变化趋势符合环境压力模型。

(2)利用综合评价指标水质健康指数进行水质预警，0．1 mg/L汞污染水体中6 h内未发生报警，而通过对斑马鱼游动行为和通讯行为等多项指标的分析，选取游动高度作为汞污染后的斑马鱼行为异常指标，可将预警时间缩短到3 h。

(3)探索不同种类污染物暴露下鱼体更为灵敏的行为反应信号，获取精确的分析数据并优化分析方法，在水质突发污染的初期及时做出预警并实现污染物的初步定性将是未来工作的重点。

［1］黄东龙，周勤．水体突发性重金属污染胁迫下斑马鱼的行为反应分析［J］．环境监测管理与技术，2011，23(4):27-31．

［2］赵晓艳，刘丽君，聂湘平，等．利用多物种净水监测仪在线监测水体抗生素药物及有机磷农药［J］．环境科学学报，2010，30(1): 180-185．

［3］黄毅，张金松，韩小波，等．斑马鱼群体行为变化用于水质在线预警的研究［J］．环境科学学报，2014，34(2):398-403．

［4］刘勇，付荣恕，任宗明．2种有机磷农药联合胁迫下日本青鳉的逐级行为响应［J］．环境科学，2010，31(5):1328-1332．

［5］Barry M J．Application of a novel open-source program for measuring the effects of toxicants on the swimming behavior of large groups of unmarked fish［J］．Chemosphere，2012，86(9):938-944．

［6］Kang I J，Moroishi J，Yamasuga M，et al．Swimming behavioral toxicity in Japanese medaka(Oryzias latipes)exposed to various chemicals for biological monitoring of water quality［M］//Kim Y，Platt U，Gu M B，et al．Atmospheric and Biological Enviromental Monitoring．［S．l．］: Springer Netherlands，2009:285-293．

［7］王代贞，王渊．汞的甲基化与甲基汞对人类的危害［J］．贵州师范大学学报(自然科学版)，1991，9(3):49-55．

［8］于常荣，王炜，梁冬梅，等．松花江水体总汞与甲基汞污染特征的研究［J］．长春地质学院学报，1994，24(1):102-109．

［9］张金洋，王定勇，胡玉娟．水库汞污染研究进展［J］．四川环境，2005，24(1):57-59．

［10］长江口及邻近海域环境污染研究的必要性——以汞为例［J］．长江流域资源与环境，2005，14(2):205-207．

［11］黄毅，张金松，韩小波，等．氯化镉和敌敌畏突发胁迫下斑马鱼的行为差异［J］．生态毒理学报，2012，7(6):671-676．

［12］黄毅．基于斑马鱼行为变化的水质预警研究［D］．西安:西安建筑科技大学，2014．

［13］汪红军，李嗣新，周连凤，等．5种重金属暴露对斑马鱼呼吸运动的影响［J］．农业环境科学，2010，29(9):1675-1680．

［14］Gerhardt A，Bisthoven L D，Soares M A．Evidence for the stepwise stress model gambusia holbrooki and daphnia magna under AMD and ARWS［J］．Environmental Science＆Technology，2005，39(11): 4150-4158．

［15］Chew B F，Eng H L，Thida M．Vision-based real-time monitoring on the behavior of fish school［C］//IAPR Conference on Machine Vision Applications．Yokohama，Japan:MVA Organization，2009:90-93．

Technology of Behavior-based Biological Warning of Sudden Mercury Pollution in Water

LU Nannan1，SUN Shaohua1，SONG Wuchang1，DU Juanjuan2，JIA Ruibao1
(1．Shandong Province City Water and Drainage Water Quality Monitoring Center，Jinan250021，China;2．School of Municipal and Environmental Engineering，Shandong Jianzhu University，Jinan250101，China)

In view of the present situation that early warining of sudden water pollution is difficult，this paper simulates sudden mercury pollution to conduct the research on biological early warning technology based on fish behavior．Based on the behavior changes of zebrafish in normal water，the paper captures and analyzes the swimming behaviors(swimming speed，swimming depth，turning frequency and accelerated speed)and fish school behaviors (average distance，dispersion)of zebrafish under 0．1mg/L mercury exposure by high-speed photography tracking technology．The results show that early warning of mercury pollution could not be identified in six hours by comprehensive evaluation index，namely，water quality health index．By taking the swimming height as the monitoring indicator for sudden mercury pollution of waterbody，early warning time could be shortened to three hours．

mercury;sudden water pollution;zebrafish;behavioral change;biological warning technology

X52;X17

ADOI:10．13578/j．cnki．issn．1671-1556．2016．05．011

1671-1556(2016)05-0069-04

贾瑞宝(1968—)，男，博士，研究员，主要从事饮用水安全保障领域的关键技术研发和工程应用研究。E-mail:jiaruibao68@ 126．com

2016-03-11

2016-03-31

山东省自然科学基金项目(ZR2014CP019);国家水体污染控制与治理科技重大专项项目(2012ZX07404-003);直饮水科技惠民示范工程项目(2013GS370202)

逯南南(1984—)，女，硕士，工程师，主要从事饮用水安全保障方面的研究。E-mail:nanwang316@163．com