功劳叶提取物的体外抗菌活性研究

蒲忠慧，王保山，陈希文，王雄清，邓思霞，周小琴（.绵阳师范学院生命科学与技术学院，四川绵阳6000；.北京生泰尔生物科技有限公司，北京大兴0600）



功劳叶提取物的体外抗菌活性研究

蒲忠慧，王保山2，陈希文1，王雄清1，邓思霞1，周小琴1
（1.绵阳师范学院生命科学与技术学院，四川绵阳621000；2.北京生泰尔生物科技有限公司，北京大兴102600）

摘要：采用水提法和乙醇回流加热法分别提取功劳叶，应用牛津杯法和试管二倍稀释法分别检测功劳叶提取物对试验菌的抑菌圈直径、最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Consistency，MIC）和最低杀菌浓度（Minimum Bactericidal Consistency，MBC）。结果显示，功劳叶醇提物金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别为20.69 mm、15.40 mm；MIC值分别是31.3 mg/mL、125 mg/mL；MBC值分别是62.5 mg/mL、＞500 mg/mL。功劳叶水提物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈13.54 mm，其MIC值、MBC值分别是62.5 mg/mL、500 mg/mL，对大肠杆菌抗菌活性较弱，其MIC值为500 mg/mL，MBC＞500 mg/ mL。功劳叶不同提取物对细菌的抗菌活性有所差异，功劳叶醇提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均由不同程度的抑菌或杀菌能力。

关键词：功劳叶；抗菌活性；MIC；MBC

十大功劳（Mahonia japonica）属于小檗科（Ber⁃beridaceae）十大功劳属（Mahonia），该属植物为多年生小灌木[1]，资源丰富，产量多，在我国民间药用已久，以根、茎入药的称为功劳木，以叶入药的称为功劳叶。现代药理研究证明，功劳叶具有抗菌[2]、消炎[3]、抗癌[4-5]、抗病毒、抗心率失常、抗血小板聚集以及清热燥湿、泻火解毒的功效[1]。其主要活性成分为小檗碱[6]，又称黄连素，临床上用于细菌性痢疾、伤寒、肺结核、急性扁桃体炎等症。

近年来，关于十大功劳属植物主要集中于其化学成分进行的研究，虽有功劳在抗病原微生物的初步应用探索[3，7]，但对畜禽细菌性疾病的主要致病菌的抑制作用报道较少。基于此，本研究拟选用当地生长的功劳叶，采用水提法与醇提法分别对猪源的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行抑菌试验，旨为在畜禽疾病防治中充分利用当地资源和进一步开发植物药提供了新的途径。

1　材料与方法

1.1菌株与培养基致病菌：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，均由绵阳师范学院生物基础实验中心从绵阳市某猪场患病猪的病料中分离所得。

MH肉汤培养基（Mueller-Hintonbroth），购自北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20130726；营养琼脂培养基（Nutrienta agar），购自北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20130702。

1.2中药功劳叶（产地四川，批次130350），购自成都中药材市场。按照《中华人民共和国兽药典》（2010年版二部）十大功劳属项下鉴定合格。

1.3器材旋转蒸发仪R502B（上海亚荣生化仪器厂）；YXQ-LS立式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司）；SW-CJ-2D型双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；DNP-9052BS—Ⅲ电热恒温培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；SYC-C电热恒温调速振荡器（上海新苗医疗器械制造有限公司）；牛津杯内径（6.0±0.1）mm，外径（7.8±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm。

1.4功劳叶粗提物的制备将功劳叶粉碎后过20目筛，分别用95%乙醇回流提取、水煎煮。料液比1∶12，每种溶剂重复提取3次，时间分别为3 h、2 h、1 h。将每种溶剂3次所得滤液减压浓缩至生药质量浓度为2 g/mL，真空干燥至恒重，精密称量，计算浸膏得率。

1.5体外抑菌试验

1.5.1菌悬液的制备将供试菌种接种于营养琼脂斜面培养基上进行活化，37℃恒温培养18～24 h，然后在超净工作台内用接种环挑取活化后的单个菌落接种于新鲜的MH肉汤培养基中，置37℃恒温箱中培养18～24 h作为原菌液，采用平板菌落计数法，用无菌生理盐水将受试菌株调至1×106～107CFU/mL，备用[8]。

1.5.2牛津杯法测定抑菌活性采用牛津杯法测定抑菌活性[9]。用微量移液器吸取0.2 mL菌液于制备好的营养琼脂固体培养基中，用无菌玻璃耙涂布均匀，并用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中。在水平放置的平皿中均匀地放置4个牛津杯，其中3个各加入同种药液50 μL，另外1个加入相应的溶剂作阴性对照。随后放入37℃恒温培养箱中培养24 h后，移去牛津杯，用游标卡尺测量抑菌圈的直径（按十字交叉法测量菌落直径2次，取其平均值）。

抑菌效果判定[10]：抑菌圈直径＞20 mm为极敏感；在15～20 mm为高度敏感；在10～15 mm之间为中度敏感；抑菌圈直径＜10 mm为低度敏感。

1.5.3最小抑菌浓度的测定采用试管二倍稀释法[11-12]。取已灭菌且编号试管9支，先在1～8号试管加MH肉汤2 mL，然后吸取功劳叶提取物（浓度为1 g/mL）2 mL移入1号试管，充分混匀后倍半稀释，向上述每管加菌悬液50 μL，同时设MH对照管、菌液对照管，使每管中的药物浓度分别为500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.3 mg/mL、15.6 mg/mL、7.8 mg/mL、3.9 mg/mL。每管3个重复，置37℃置摇床（150 r/min）培养24 h后，肉眼观察试管内液体澄清的最低药物浓度记为最低抑菌浓度（MIC）。

1.5.4最小杀菌浓度的测定在MIC结果的基础上，从肉眼可见无浑浊的试管中吸取50 μL液体涂布于营养琼脂固体平板上[13]，37℃恒温培养24 h后，以杀灭99.9%细菌数量的最低浓度或者培养板上无菌落生长的最低浓度记为MBC。试验重复3次。

2　结果

2.1功劳叶粗提物的抑菌活性比较采用牛津杯法分别测定了功劳叶水提物、醇提物在2 g/mL的生药浓度下为对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外抑菌活性，结果见表1及前插彩版图1～3。由表1可知：与阴性对照相比：功劳叶醇提物对2种供试菌具有不同程度的抑菌活性，对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好，抑菌圈直径为20.69 mm；呈极敏性，对大肠杆菌（15.40 mm）表现出高敏性；功劳叶水提物对金黄色葡萄球菌抑菌效果相对较好，抑菌圈直径为13.54 mm表现出中敏性，对大肠杆菌抑菌直径＜10 mm为低度敏感。以上结果说明了功劳叶醇提物抑菌效果优于水提物，从提取得率来看，水提物得率（16.64%）略高于醇提物（13.58%）。

表1　功劳叶提取物对供试菌的体外抑菌活性

2.2最低抑菌浓度（MIC值）采用试管二倍稀释法测定了功劳叶提取物对供试菌的MIC值，结果见表2，当功劳叶醇提物的浓度为31.3 mg/mL时，金黄色葡萄球菌生长受到抑制，试管中液体培养基澄清，当醇提物浓度为125 mg/mL，大肠杆菌生长明显受到抑制；当功劳叶水提物的浓度为250 mg/mL时，金黄色葡萄球菌生长受到抑制，当水提物浓度为500 mg/mL，大肠杆菌试管仍显浑浊。阴性对照组中各试验菌均表现出较强的生长优势。由此得出，功劳叶醇提物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的MIC值分别为：31.3 mg/mL、125 mg/mL；功劳叶水提物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的MIC值分别为：250 mg/mL、＞500 mg/ mL。

2.3最低杀菌浓度（MBC值）在最低抑菌浓度的基础上，测得的MBC值结果见表3。由表3可知，功劳叶醇提物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的MBC值分别为：62.5 mg/mL、500 mg/mL；功劳叶水提物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的MBC值分别为：500 mg/mL、＞500 mg/mL。

3　讨论

本试验探讨了乙醇、水堤物对功劳叶活性成分抑菌效果的影响，结果显示，功劳叶醇提物抑菌效果优于水提物，根据“相似相溶”原理可知，其极性强弱为水＞乙醇，由此说明了功劳叶抑菌成分可能为中等极性成分。

表2　功劳叶提取物对供试菌的最低抑菌浓度　（MIC值）

表3　功劳叶提取物对供试菌的最低杀菌浓度　（MIC值）

体外抑菌试验表明，不同的菌种对药物的敏感度不同。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌对功劳叶醇提物分别表现为极敏（20.69 mm）和高敏（15.40 mm）；对水提物分别表现出中敏（13.54 mm）和低敏（＜10 mm）。由此说明了革兰阳性菌对功劳叶提取物的敏感性大于革兰阴性菌），即功劳叶革兰阳性菌的抑制作用强于革兰阴性菌。据金兰梅等[14]报道，功劳叶对金黄色葡萄球菌抑菌效果较强，且优于大肠杆菌，与本试验的结果相符，说明功劳叶抑菌谱广，具有较大的开发价值，但其抑菌活性具体成分尚不明确，有待进一步分离纯化。

功劳叶提取物对供试菌的MIC值、MBC值结果表明，功劳叶醇提物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有一定的抑菌和杀菌效果，对金黄色葡萄球菌的MIC值为31.3 mg/mL，MBC值为62.5 mg/ mL；对大肠杆菌的MIC值为125 mg/mL，MBC值为500 mg/mL。功劳叶水提物仅对金黄色葡萄球菌有抑菌活性，其MIC值为250mg/mL，MBC值为500 mg/mL，对大肠杆菌的MIC与MBC值均大于500 mg/mL。在抑制大肠杆菌方面，张秀英等[15]报道十大功劳叶水提物对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）范围为15.6～250 mg/mL（生药），醇提物对大肠杆菌的的MIC均大于250 mg/mL（生药），周琰冰等[16]、赵鑫荟等[17]报道，功劳叶大肠杆菌的MIC为62.5 mg/mL，本研究结果与以上报道相比有明显的差异，出现这种差异可能与功劳叶的种类、产地、提取方法，以及相同的细菌不同来源的菌株有关，有待今后进一步探讨。

临床研究证明[18-20]，功劳叶体内治疗许多感染性疾病（细菌性痢疾、流感病毒、伤寒、肺结核、急性扁桃体炎）效果很好，但本研究结果表明，其体外MIC值偏大，究其原因可能与功劳叶的抑菌机理有关，功劳叶可能与抗生素作用机制不同，其是否作用于毒素表达、表面蛋白活性或耐药性等方面，有待于进一步的研究。

参考文献：

[1]刘安莉，何顺志.中国十大功劳属药用植物资源种类与地理分布的研究[J].现代中药研究与实践，2010，4：20-24.

[2]欧阳蒲月，黄智璇，莫瑞峰.华南十大功劳提取物抑菌活性初步研究[J].亚热带植物科学，2012，41（3）：1-6.

[3]王筠默.中药十大功劳的研究[J].中医药研究，2002，18（5）：45.

[4]浙江植物志编委会.浙江植物志[M].杭州：浙江科技出版社，1992.

[5] Lin J G，Chung J G，Wu L T，et al.Effects of berberine on arylamine N-acetyl transferase activity in human colon tumorcells[J] . The American Journal of Chinese Medicine，1999，27（2）：265-275.

[6]顾关云，蒋呈.十大功劳属植物化学成分与生物活性[J].国外医药·植物药分册，2005，20（5）：185-190.

[7]欧阳蒲月，朱翠霞，陈功锡，等.宽苞十大功劳提取物抑菌活性的初步研究[J].中南林业科技大学学报，2012，32（3）：166-170.

[8]钱存柔，黄仪秀.微生物学实验教程[M].北京：北京大学出版社，2000：207-208.

[9]刘冬梅，李理，杨晓泉，等.用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力[J].食品研究与开发，2006，27（3）：110-111.

[10]马兴铭，李红玉，尹少甫，等.西藏砂生槐生物碱抑菌抑瘤的实验研究[J].兰州大学学报（自然科学版），2003，3（6）：74-77.

[11] Pu Z H，Yin Z Q，Jia R Y，et al.Antibacterial activity of 9-octadecenoic acid-hexadecanoic acid- tetrahydrofuran-3，4-diyl ester from Neem Oil[J] . Agricultural Sciences in China，2010，9 （8）：101-105.

[12] Pu Z H，Jia R Y，Yin Z Q，et al.Antibacterial activity of the crude extracts of Prinsepia Utilis Royle in vitro[J] . Journal of Northeast Agricultural University，2010，1：48-52.

[13] National Committee for Clinical Laboratory Standards Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically；approved guideline 5th ed（M7- A5）[J] . National Committee for Clinical Laboratory Standards，2000，3（8）：326-332.

[14]金兰梅，伍清林，陆小松，等.竹叶等植物提取物对畜禽致病菌抑菌效果的研究[J].金陵科技学院学报，2013，29（4）：80-84.

[15]张秀英，高光，段文龙，等.十大功劳对大肠杆菌耐药性的消除作用[J].中国兽医学报，2012，32（1）：108-110.

[16]周琰冰，赵鑫荟，艾启俊.三种中草药对大肠杆菌的抑制作用及机理初探[J].中国农学通报，2014，30（21）：294-300.

[17]赵鑫荟，艾启俊.18种中草药对大肠杆菌抑菌效果的研究[J].安徽农业科学，2013，41（2）：599 -600.

[18]姚凤莉，尹晓丹，安育林.十大功劳叶、生甘草联合阿奇霉素治疗小儿支原体肺炎的疗效观察[J].现代中西医结合杂志，2010，19（20）：2479 -2480，2483.

[19]黄聪.肺结核[J].健康生活，2003，3：41.

[20]曾祥英，劳邦盛，董熙昌，等.阔叶十大功劳根中生物碱组分体外抗流感病毒试验研究[J].中药材，2003，26（1）：29-30.

Studies on the Antimicrobial Activity of Extract from Mahoniain vitro

PU Zhong-hui，WANG Bao-shan2，CHEN Xi-wen1，WANG Xiong-qing1，DENG Si-xia1，ZHOU Xiao-qin1
（1.College of Life Science and Technology of Mianyang Normal University，Mianyang 621000，China；2.Beijing Centre Biology Co.，Ltd.Beijing 102600，China）

Abstract：The extracts of Mahonia was prepared by water extraction and 95%ethanol refluxing method . Two extracts were used to do drug sensitive test by Oxford Plate and the tube dilution method was used to determine the Minimum Inhibitory Consistency（MIC）and Minimum Bactericidal Consistency（MBC）against Staphylococcus aureus and Escherichia coli.The results showed that antibacterial circle diameter of the ethanol extraction against Staphylococcus aureus and Escherichia coli was 20.69 mm and 15.40 mm，the MIC was 31.3 mg/mL and 125 mg/mL，and the MBC was 62.5 mg/mL and greater than 500 mg/mL，respectively.Antibacterial circle diameter of the water extraction against Staphylococcus aureus was 13.54 mm，the MIC and MBC were 62.5 mg/mL and 500 mg/mL，respectively.Escherichia coli was less sensitive to the water extraction of the Mahonia.The MIC was 500 mg/mL and the MBC was greater than 500 mg/mL.Different extracts showed different antibacterial activities to Staphylococcus aureus and Escherichia coli.The Mahonia ethanol extraction has good inhibitory effect on Staphylococcus aureus and E.coli.

Key words：Mahonia；antimicrobial activity；MIC；MBC

Corresponding author：WANG Xiong-qing

通讯作者：王雄清，E-mail：wangxq193@126.com

作者简介：蒲忠慧（1982-），女，讲师，博士生，从事中药药理研究，E-mail：zhonghui.pu@163.com

基金项目：四川省科技厅科研项目（2013JY0127）

收稿日期：2014-11-28

中图分类号：R 281.4

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）01- 0109- 03