规模化鹅场发生多种血清型鸭疫里默菌的混合感染

罗雪刚，夏文君，李　阁，罗永芳，彭少静，周　念，李继祥（.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌40460；.重庆永健生物技术有限公司，重庆　荣昌40460）



规模化鹅场发生多种血清型鸭疫里默菌的混合感染

罗雪刚1，夏文君1，李阁2，罗永芳1，彭少静1，周念1，李继祥1
（1.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌402460；2.重庆永健生物技术有限公司，重庆荣昌402460）

鸭疫里默菌（Riemerella anatipestifer，RA）为革兰阴性小杆菌、无芽孢、不能运动、有荚膜，主要感染家鸭、鹅、火鸡，但也有感染鸡的报道[1]。该细菌血清型复杂且缺乏交叉免疫保护、耐药性严重，导致疾病难以预防和治疗。2014年5月中旬，重庆荣昌县某规模化鹅场的18日龄鹅发病，21日龄时发病率约为30%、死亡率为10%左右，病死鹅表现为典型的心包炎、肝周炎和气囊炎。经西南大学荣昌校区实验室诊断，该病为多血清型鸭疫里默菌混合感染，现将病例诊断结果报道如下。

1　材料与方法

1.1病例重庆荣昌县某规模化鹅场饲养的肉用四川白鹅5 000余只，18日龄鹅发病，病鹅精神沉郁、食欲下降、羽毛蓬松、呼吸困难，眼鼻分泌物增多、粪便稀薄呈绿色，腿软弱、跗关节肿大、腿部皮温明显高于体温，临死前表现为头颈扭斜、抽搐等神经症状。发病鹅采用网上平养、密度适中、未免疫鸭疫里默菌疫苗、未使用抗菌药物，鹅苗购自四川隆昌县禽苗市场。2只送检病鹅均表现为心包炎、肝周炎和气囊炎，脾脏肿大，脑膜充血、出血。

1.2细菌分离鉴定利用巧克力和麦康凯营养琼脂平板从送检鹅的肝、脑组织分离细菌，典型菌落纯培养后从细菌形态、生化特性和鸭疫里默菌cam基因检测[2]等方面进行鉴定。

1.3病毒检测病死鹅肝组织匀浆反复冻融3次后离心上清液利用病毒RNA/DNA快速提取试剂盒（TaKaRa产品）提取RNA/DNA用于小鹅瘟[3]、禽流感[4]和鸭甲肝病毒[5]检测。

1.4鸭疫里默菌血清鉴定鸡抗鸭疫里默菌血清（1型、2型、4型、8型和14型），自制，-80℃保存[6]。将分离鉴定的鸭疫里默菌用巧克力平板纯培养，按张大丙（1999）[7]报道的玻片凝集试验进行血清型鉴定。

1.5体外药敏试验药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司，药敏试验方法和判定标准按使用说明书进行。

1.6动物试验经鉴定为鸭疫里默菌的分离菌株用巧克力平板培养（37℃、24 h），生理盐水悬浮，测定细菌数。14日龄健康鸭每只腿部肌肉接种约1×108CFU/0.2 mL的菌悬液，连续7 d观察发病死亡情况，死亡病鸭进行剖检与细菌回归试验。

2　结果

2.1细菌分离鉴定病死鹅肝和脑组织划线接种巧克力培养基，37℃培养24 h后有表面光滑、稍突起的露珠状菌落形成；用麦康凯平板没有分离出细菌；利用RT-PCR或PCR没有从病死鹅肝组织中检测到小鹅瘟病毒、禽流感病毒和鸭甲肝病毒。单菌落纯培养物染色镜检为革兰阴性小杆菌、无鞭毛和芽孢；瑞氏染色呈菌体两极浓染。生化试验结果显示，分离菌株能液化明胶、不发酵糖、不产生靛基质和硫化氢、不还原硝酸盐，过氧化氢酶阳性。利用鸭疫里默菌cam基因的特异性引物对分离菌的基因组DNA进行PCR，扩增产物经琼脂糖电泳检测为1 000 bp左右的单一DNA条带。

2.2血清型鉴定从每只送检鹅肝、脑组织划线分离的细菌中随机挑取5个菌落纯培养，经鉴定为鸭疫里默菌后用于血清型鉴定。从第1只鹅脑组织分离的5株鸭疫里默菌中血清2型3株、血清4型2株；从肝脏分离的细菌中血清2型2株、血清4型2株和未定型1株。从第2只鹅分离10株细菌中，除分离于脑的1株细菌为血清14型外，其余均为血清4型。

2.3细菌体外药敏试验从鉴定血清型的20株鸭疫里默菌中选取8株细菌进行的体外药敏试验结果见表1。分离菌株对阿莫西林的敏感性好，多数菌株对头孢曲松、罗红霉素等的敏感性差，甚至完全耐药。同时从表1可知，分离于同一只病鹅的相同血清型菌株间的耐药性存在明显差异，如分离于第1只病鹅脑组织的血清2型菌株（菌株1）对恩诺沙星耐药（11.8 mm），而分离于肝组织的（菌株3）则敏感（18.0 mm）。

2.4致病性试验测定药物敏感性的8株细菌1×108CFU/0.2 mL都能在24～36 h内引起14日龄接种鸭发病、在48～60 h内发生死亡、在120 h内100%（7/7）死亡。病死鸭剖检大体病变为典型的心包炎、肝周炎和气囊炎；都能从脑和肝脏组织中分离出与接种细菌相同血清型的鸭疫里默菌。

表1　体外药物敏感性试验抑菌圈的直径（mm）及敏感性判定

3　讨论

鸭疫里默菌感染鹅发病的病例报道较多，但同一鹅群存在多种血清型菌株感染，甚至从同一只病死鹅中分离鉴定出3种血清型菌株的病例未见报道。从细菌分离鉴定、动物试验和血清鉴定等确诊重庆荣昌某规模化鹅场18日龄鹅发病是由4种血清型的鸭疫里默菌混合感染所致。在病例诊断中，从病理剖检的第1只病死鹅组织中分离鉴定出3种血清型（2型、4型和未定型）鸭疫里默菌，第2只中鉴定出2种（4型和14型）；不同菌株的药物敏感性有差异，即使是分离于同一病死鹅的同一血清型的不同菌株间也存在明显的差异。鸭疫里默菌多血清型菌株混合感染鹅群的原因在于：种鹅的小规模饲养，雏鹅来源多样化；雏鹅在禽苗市场集中交易导致交叉感染；饲养场没有实行全进全出及严格的消毒，污染严重；养鹅场附近存在养鸭场，有从鸭传染鹅的可能。

疫苗免疫预防和抗菌药物防治是控制鸭疫里默菌感染的2种途径，由于同一群体中存在多血清型菌株感染，且药物敏感性不一致，这使得生产实际中药物和疫苗的效果难以保证。因此，对于鸭疫里默菌感染的控制应采用全面实施生物安全措施的策略。

参考文献：

[1] Li J X，Tang Y，Gao J Y，et al.Riemerella anatipestifer infection in chickens[J].Pak Vet J，2011，31（1）：65-69.

[2] Karen C C，Chua K L，Sumathi S，et al.Identification and characterization of cAMP cohemolysin as a potential virulence factor of Riemerella anatipestifer[J] . J Bacteriol，2002，184（7）：1932-1939.

[3] Chang-kwang Limn，Takahiro Yamada，Masayuyki Nakamura，et al.Detection of Goose parvovirus genome by polymerase chain reaction：istribution of Goose parvovirus in Muscovy ducklings[J] . Virus Res，1996，42：167-172.

[4]王秀荣，孙明，刘明，等.禽流感病毒RT-PCR试验方法.中华人民共和国农业行业标准NY/T 772-2004.

[5] Gan Y J，Huang C H，Wang X Z，et al.Epidemiological Investigation of Duck Hepatitis A Virus（DHAV）Isolated from Sichuan Basin by RT-PCR Disclose the Existence of Mixed Infection and the Feasibility of DHAV-A Evolved from C80 Strain[J] . Pak Vet J，2014，34（3）：356-360.

[6]李继祥，黄伟，高继业，等.西南地区鸭传染性浆膜炎病原流行病学研究[C].中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立2 0周年庆典暨第十次学术研讨会论文集，苏州：2003：995-997.

[7]张大丙，郭玉璞.我国鸭疫里默氏杆菌血清型的鉴定[J].畜牧兽医学报，1999，30（6）：536-542.

通讯作者：李继祥，E-mail：jixianglucky@126.com

作者简介：罗雪刚（1990-），男，博士生，主要从事动物疾病的诊断研究，E-mail：122453213@qq.com

收稿日期：2014-06-13

中图分类号：S852.61+8

文献标志码：B

文章编号：0529- 6005（2016）01- 0052- 02