葫芦科蔬菜单倍体育种技术研究进展——花药和游离小孢子培养技术

董彦琪，黄金华，刘喜存，王文英，王玲燕，朱红彩

（河南省新乡市农业科学院 河南新乡 453000）

葫芦科（Cucurbitaceae）植物包括118个属825个种，广泛分布于热带和亚热带地区。在我国分布约有130个种，且多为人们所喜爱的瓜类蔬菜，如西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum.&Nakai]、甜瓜（Cucumis melo L.）、黄瓜（Cucumis sativus L.）和南瓜（Cucurbita pepo L.）等，他们的复合杂交育种需要某些具有优良性状的材料。此类材料的制备一般要经历很长时间的筛选和纯合，单倍体育种技术为葫芦科育种材料的制备开辟了一条简便快捷的途径，不但可以获得较多基因型的植株，筛选到符合目标性状的材料，而且可以大大缩短育种时间，节省人力和物力。

由于葫芦科蔬菜自然发生单倍体的频率极低，为了获得较多的单倍体植株，国内外主要通过一些生物技术途径。花药培养和小孢子培养途径属于离体雄核发育途径（in vitro androgenesis）[1-4]，将发育到一定阶段的花药通过无菌操作技术接种到培养基上，改变发育程序诱导分化出胚状体，形成愈伤组织，随后使愈伤组织分化成完整植株的过程。利用该技术可快速获得纯系、缩短育种周期、加速育种进程[5]。本文侧重综述了影响该技术的一些重要因素，如基因型、小孢子发育时期、生长环境、接种密度、培养基、生长调节剂、碳源、活性炭、三十烷醇、低温预处理、热激处理、倍性鉴定及植株再生等，为该技术的开展和应用提供可行的理论依据。

1 基因型

不同基因型间愈伤组织诱导率相差很大，选择合适的基因型是花药培养成功的关键[6-7]。谢淼等[8]研究发现，所用的不同黄瓜品种花药培养都可以诱导出愈伤组织，但诱导率和质量不一样；詹艳等[9]对10份黄瓜供试材料进行花药培养，只有4份试材获得了胚状体。Song等[10]用16个不同黄瓜品种进行花药培养，其中‘Ningjia No.1’出胚率最高。詹艳等[9]在黄瓜游离小孢子培养中也证实基因型是影响胚诱导的重要因素，不同基因型产胚量差异很大，最多的为每皿33.4胚，最少的为每皿1.5胚。

2 小孢子发育时期

适宜的花粉发育阶段对诱导雄性单性生殖至关重要，是决定诱导能否成功及诱导频率高低的内在因素之一。瓜类花药培养中，花粉发育阶段有一定的差异。西瓜花粉单核中期至晚期花药培养效果较好[2]，李娟[11]运用DAPI荧光染色法，镜检观察横径0.3～7.0 mm的西瓜雄花花蕾，结果表明花蕾横径在2.0～4.0 mm时，小孢子处于单核靠边期。谢淼等[8]和詹艳等[9]研究表明黄瓜花药处于单核中后期（花蕾长度为0.9～1.5 mm）时较适合培养；Metwally等[4]研究表明西葫芦小孢子处于单核中期至单核晚期花药培养效果较好。

3 生长环境

供体植株的生长环境对小孢子活力及培养效果也有一定影响。Mohamed等[12]报道，西葫芦花药培养种植材料冬季的出胚率是夏季的2倍多。谢淼等[8]研究表明黄瓜花药培养试验中发现由于诱导率与季节有关，春季（4月）比秋季（10月）的效果好。

4 接种密度

接种密度与诱导率成正相关。接种密度不可过大，以尽量减轻花药在空间和营养上的竞争；但也不能过小，否则不利于促进物质的形成，也不利于愈伤组织的形成。詹艳等[9]在黄瓜游离小孢子培养中采用的小孢子密度为2×105个·mL-1。

5 培养基成分

5.1 基本培养基

一般选用MS作基本培养基。初期的研究中西瓜愈伤组织易褐变且诱导率不高[13]，袁万良等[14]和魏瑛等[15]通过改良培养基解决了西瓜愈伤组织褐变死亡问题；袁万良等[14]将分化阶段西瓜愈伤组织的诱导率从0.5%提高到94.4%，并快速诱导出绿色愈伤组织。西葫芦花药培养中[4]也选用MS作为花药愈伤组织诱导培养基。谢淼等[8]在黄瓜花药培养中选用MS和B5作为基本培养基。

5.2 生长调节剂

基本培养基能保证培养物的生存与最低生理活动，但只有配合使用适当的激素，才能诱导细胞分裂、愈伤组织生长以及芽和根的分化等。前人在瓜类花药培养的研究中表明[4，10，12，16]，对愈伤组织诱导率影响最大的是2，4-D。Kumar等[17]在黄瓜花药培养中发现，2个品种对2，4-D（质量浓度0.44 mg· L-1）反应不完全一致，‘Calypso’直接发育成胚，而‘Green Long’经愈伤组织发育成胚。詹艳等[9]在黄瓜花药培养中发现低质量浓度的2，4-D（0.5 mg·L-1）有利于胚形成；Rakha 等[18]研究表明随着 2，4-D质量浓度（从1.0到5.0 mg·L-1）增加，形成的愈伤组织越来越少。

耿晨光等[19]认为6-BA能显著提高愈伤组织的诱导率，配合2，4-D和KT使用效果更好。詹艳等[9]研究表明低质量浓度的 6-BA（0.2 mg·L-1）有利于黄瓜胚形成。Kumar等[17]研究认为ABA能促进胚发育成熟，并随之发育成正常植株。Song等[10]研究认为有利于黄瓜胚发育的BA和KT最佳质量浓度为 1.0 mg·L-1和 1.25 mg·L-1。

5.3 碳源

5.3.1 蔗糖 蔗糖一直被认为是植物组织培养的标准碳源而被广泛应用，他不仅能给外植体提供能量，而且也能维持一定的渗透压。Metwally等[4]在西葫芦花药培养中发现当诱导培养基中的蔗糖质量浓度为150g·L-1时的再生植株最多。陶正南[20]在甜瓜愈伤组织诱导中采用的蔗糖质量浓度为60 g·L-1，分化培养基中的质量浓度为30 g·L-1。Kumar等[21]研究表明诱导黄瓜胚胎形成的最佳蔗糖质量浓度为 85 g·L-1，分化时则为 30 g·L-1。羊杏平等[22]研究表明高质量浓度的蔗糖不利于西瓜小孢子的存活，‘特大凤’和‘こがね小玉’在质量分数为13%的蔗糖处理中的小孢子活性均高于10%和16%的蔗糖处理。

5.3.2 甘露醇 甘露醇通过影响培养基的渗透压而影响小孢子的发育。羊杏平等[22]研究表明，西瓜品种‘新小兰’和‘黑美人’对甘露醇的反应不一致。未添加甘露醇（对照）的‘新小兰’小孢子活性最高，且随着添加甘露醇浓度的增加‘新小兰’小孢子活性急剧下降；‘黑美人’小孢子活性则随甘露醇浓度的增加呈先增加后下降趋势，甘露醇质量浓度为10 g·L-1时小孢子活性达到最大值，为92%。

5.4 活性炭

在瓜类的花药培养中，有关活性炭对培养过程的影响报道极少。加入活性炭的目的主要是利用其吸附性，减少有害物质的不利影响（如活性炭能吸附一些酚类物质，可以减轻愈伤组织的褐化，吸收琼脂中的杂质等）。此外，创造暗环境有利于某些植物生根。但是活性炭也能吸附有益物质，如NAA、KT、6-BA、Fe-EDTA。喻财铃[24]在丝瓜花药培养中明确提出活性炭的效果差，有抑制作用。

5.5 三十烷醇

三十烷醇生理活性很强，使用浓度较低，具有促进生根、发芽等功用，但三十烷醇在花药培养中的作用尚未清楚。袁万良等[14]发现加入一定浓度的三十烷醇，西瓜愈伤组织全部变为绿色，并形成深绿色点状组织，提高了再生植株的诱导率。李娟等[11]的研究也表明三十烷醇对西瓜愈伤组织的分化至关重要，在 MS+2.0 mg·L-1三十烷醇+0.5 mg·L-16-BA培养基上培养30 d后，愈伤组织能成功分化出丛生芽。

羊杏平等[22]在 NLN+0.2 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-12，4-D的培养基中添加三十烷醇能够促进‘新小兰’小孢子活性，在培养3 d时，‘新小兰’小孢子存活率达到最高值，为84%，而未加三十烷醇的小孢子存活率只有46%。而‘早春红玉’对三十烷醇的反应与‘新小兰’刚好相反，三十烷醇抑制了‘早春红玉’的小孢子存活率，且随培养时间的延长，小孢子活性显著下降。王开冻等[23]研究也表明，三十烷醇只对诱导和保持绿色愈伤组织有利，对促进不定芽形成的效果不明显。

6 处理方法

6.1 低温预处理

低温预处理是花药培养中比较常见的培养方法。4 ℃是较为适宜的预处理温度[4，8，20-26]，但不同蔬菜作物处理时间不完全一致。

刘林[25]利用显微切片技术研究了低温（4～6℃）条件下西瓜品种‘京欣三号’花药的细胞形态学变化，结果表明，小孢子母细胞和绒毡层细胞是花药中对低温最敏感的细胞；小孢子母细胞时期和减数分裂前期是对低温最敏感的发育阶段。魏瑛[26]研究表明4℃低温条件下西瓜花药处理72 h效果较佳；羊杏平等[22]研究表明西瓜‘金玉玲珑’和‘拿比特’4℃低温处理2 d的小孢子存活率高于对照，但4℃处理4 d后2品种的小孢子存活率均较对照显著下降，其原因可能是处理时间过长，影响了小孢子继续发育，致使单核靠边期的小孢子数量减少；而朱迎春等[27]研究认为4℃低温处理48 h和72 h时，西瓜花药培养愈伤组织诱导率均较高。

Kumar等[21]研究表明黄瓜花蕾在4℃条件下处理2 d的效果最佳；谢淼等[8]认为黄瓜适宜处理时间是48～72 h。Metwally等[4]研究表明西葫芦处理时间4 d效果较好。喻财铃[24]研究表明4～7℃的低温处理可以显著地提高丝瓜愈伤组织的诱导率，且在4～8 d内随着处理时间的延长，愈伤组织诱导率增高。

6.2 热激处理

热激处理温度对愈伤组织或胚状体的形成以及促进其生长都有重要作用。李娟等[11]研究表明36℃热激4 d时，西瓜小孢子的脱分化效果好。其中，‘271’小孢子脱分化率最高，达4.01%。羊杏平等[22]研究表明西瓜小孢子活性随热激处理时间的增加呈先上升后下降的趋势，35℃热激4 d时‘金玉玲珑’和‘拿比特’小孢子存活率均最高，分别为68.33%和66.00%。

7 倍性鉴定与植株再生

7.1 倍性鉴定

Dryanovska等[3]发现了自然加倍现象。然而大多学者研究证明，瓜类花药培养中，单倍体、多倍体或与非整倍体现象并存。如Metwally等[4]在西葫芦花药培养中的研究表明，单倍体植株和二倍体植株各占50%；Mohamed等[12]在西葫芦花药培养中发现60%植株是单倍体、23%植株是二倍体、17%植株是非整倍体，用秋水仙碱处理得到的二倍体植株能正常开花结果；薛光荣等[13]对生根植株随机取样，用铁矾苏木精染色法，多次检定根尖细胞染色体数，均可见单倍体植株细胞2n=x=11和具有一定数量的非整倍体细胞；Kumar等[21]在西葫芦花药培养中的研究表明，‘Calypso’单倍体植株和二倍体植株分别是80%和20%；‘Green Long’单倍体植株和二倍体植株分别是60%和40%。

7.2 植株再生

薛光荣等[13]将诱导的西瓜花药愈伤组织转移到MS+2.0～4.0 mg·L-1三十烷醇的分化培养基上分化出发育正常、叶色浓绿的植株；再将分化出的植株转入 1/2 MS+0.2 mg·L-1IBA+1.0 mg·L-1IAA 或转入1/2MS+1.5 mg·L-1IAA生根培养基上，10 d左右生根。刘林[25]研究表明，西瓜花药愈伤组织诱导最佳培养基为MS+0.5mg·L-1KT+1.5mg·L-16-BA+1.0mg·L-1NAA 和 MS+1.5 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA+1.5mg·L-1NAA，增殖分化最佳培养基为MS+1.0mg·L-1NAA+0.25 mg·L-16-BA，但最终未能诱导出不定芽。朱迎春等[27]在西瓜花药培养中发现，野生西瓜在3种诱导培养基和2种分化培养基上诱导率均较高，在大量元素NH4+减半的MS+0.5 mg·L-1IBA+3.0%蔗糖+0.7%琼脂的生根培养基上生根率达80%以上，且根系健壮。

8 问题与展望

利用瓜类花药培养和游离小孢子培养技术获得单倍体植株是一个较为成功的途径，众多国内外学者研究了一些影响因素，在基因型、小孢子发育时期、生长环境、接种密度、培养基、生长调节剂、碳源、活性炭、三十烷醇、低温预处理、热激处理、倍性鉴定及植株再生等方面并取得了一些重要进展。如处于中期至单核靠边期的花粉最易诱导胚胎发生，而其他时期的小孢子则不宜诱导成胚，因此小孢子发育时期是影响诱导成胚的关键因素；由西瓜花药愈伤组织分化形成不定芽是比较困难的，外界激素起着重要作用，如 2，4-D、6-BA、KT、三十烷醇等对愈伤组织诱导起很大的促进作用，但还存在愈伤组织褐化和不定芽玻璃化现象，使用激素时应考虑外植体内源激素水平和激素间相互配合作用等因素；4℃低温预处理是保存花蕾的一种有效方式，热激处理（35℃或36℃）促进愈伤组织的形成，但低温预处理和热激处理对小孢子发育途径的影响机制尚未见报道。

利用花药培养和游离小孢子培养技术已在黄瓜、西瓜、甜瓜、西葫芦、丝瓜等瓜类作物上获得了单倍体胚和单倍体植株，该技术为研究离体雄核发育机制、开展更广泛的雄核（花药和游离小孢子）单倍体培养奠定了基础。游离小孢子培养技术是一种更高效的单倍体胚诱导和植株再生技术，然而在瓜类作物单倍体育种中报道较少。深入探索瓜类游离小孢子培养技术、建立高频小孢子胚诱导和植株再生体系是今后育种工作者研究的重要方向。