基于EST的茶树分子生物学研究

冯素萍，刘　超，徐桢贞（海南热带海洋学院，海南三亚572200）



基于EST的茶树分子生物学研究

冯素萍，刘超，徐桢贞
（海南热带海洋学院，海南三亚572200）

摘要：本文通过对茶树40对引物的EST序列设计，研究茶树分子生物学EST-SSR引物的开发与通用性，并挑选其中多态性和稳定性较好的13对引物，经研究分析得到其重复基序多超过18bp，且通用率高达46%以上，从而充分验证茶树分子EST序列引物的通用性特征。那么，下面将重点研究基于EST的茶树分子生物学特征。

关键词：茶树；EST；茶树分子；生物学

对EST-SSR引物进行PCR试验，由聚丙烯胺凝胶电泳加以验证，统计出聚丙烯胺凝胶电泳的条带数目并分类与分析，然后按照EST-SSR多态性利用软件来分析聚类，建构相应的系统树，以此辨识不同茶树的亲疏关系，归纳茶树分类法。分析茶树遗传构造，讨论茶树的生物学性状存在差异性的遗传学原理，并验证EST序列和设计SSR引物的可行性与实际作用，最终试验验证EST-SSR在生物种之间通用性的优劣程度。

1 达序列标签-简单重复序EST-SSR

上世纪八十年代末，由美国著名科学家Venter首次提出基因组EST计划，且人类基因组试验逐步被应用于植物类试验，它可利用cDNA实现随机测序工作，以此认识基因组试验。EST-SSR具有SSR标记的优点，且兼具通用特性好、引物成本低、思路缜密和统计方便等好处。因EST-SSR源自与目标性状具有直接联系的转录区，因而利用标记分子的方法来帮助筛选育种在应用方面相较于全基因组SSR要优越的多。种质资源评价利用EST-SSR方法会体现出转录区的各异性，即反映出植物性状遗传的多样性特征。EST-SSR被定位于性状基因内部，可直接选择控制目标性状的等位基因。另外，分子标记也可用于MAS的筛选，不同植物的EST-SSR仍然存在较高的共线特征，因而可以说明该方法在作图研究与合并遗传图谱锚定位点中适用。

SSR具有生物通用性特征。由Marion S.Roder提出基于传统基因组的SSR引物的通用性特征在不同物种间表现极差，EST-SSR引物则通过较为保守的侧翼序列与稳定的SSR进化其通用性特征在不同物种间表现尚好。不同物种之间EST-SSR引物的生物通用性可保障分子标记的价值和标记数量，这一点在SSR引物中就无法得以保障。究其原因，EST-SSR的侧翼序列在不同物种间保守关系牢靠，因而使其引物可以在不同物种之间保持良好的生物通用性。

近年，有关EST研究技术水平不断提高，庞大的EST数据俨然是SSR的主要来源。据可靠数据分析，1%～5%的植物在EST中含可标记的SSR。由林范学按照FGP与NCBI检索EST序列，然后经软件处理设计EST-SSR引物，最终衍生出多态性的条带。

2 茶树分子EST-SSR标记的开发及生物学研究

讨论植物物种种质的资源分类，茶树的生理分化类别一直在完善中，而分子标记技术水平也在不断提高。然而，茶树SSR研究对比其他物种分子标记要相对滞后，可用引物毕竟很少，由此也导致有关茶树采取SSR标记分子的报道少之又少，成为当下阻碍SSR技术发展的重要原因。另外一方面讲，建构茶树基因库与遗传图谱系统不足也对SSR引物的设计造成了极大的影响。近年来，庞大的EST数据群作为SSR引物设计的直接来源，逐步发展起来的EST-SSR分子标记技术其实是一种建立在表达序列之上研发的微卫星分子标记技术。相较于普通SSR技术，EST-SSR分子标记技术主要依仗的是保守的侧翼序列和稳定的进化过程，由此即可保障EST-SSR引物能够在不同物种之间保有良好的通用性特征。另外，EST-SSR引物还具有在物种间灵活转移的特点，其高通用性特征也能保证分子标记的高价值和良好的标记数量，这一点在SSR方面就显得比较差。忻雅等人将EST-SSR引物与其近亲物种完成扩增，其扩增效果基本不低于50%，更有甚者可达到超过80%的扩增效果，如此之高的扩增下过间接说明EST-SSR分子标记于近亲物种之间的高通用性。ESTSSR引物与普通SSR引物通用性特征的研究报道更多集中于如玉米、蚕豆、水稻、黄豆和马尾松等经济作物。从研究结果来看，ESTSSR引物的通用性显然要高于普通SSR引物。当前，EST-SSR分子标记不仅限于对物种遗传多样性的研究，更为实际的应用则是物种种质鉴定与选育。在建构物种遗传图谱系统当中，EST-SSR分子标记技术得到了良好的发展机会。本文试验将研究EST-SSR分子标记在茶树中的应用，讨论分子标记技术开发和物种通用性问题，以期研发出一种既具有精准性又具便捷性的遗传分类引物，以此即可严重不同物种之间EST-SSR引物的高通用性特征。

本节内容以江西地区野外采集可供试验研究的17类茶树样本，然后统一采取EST-SSR分子标记技术来探讨茶树物种的通用性特征。按照EST-SSR引物能在物种间通用的基本特征，并从NCBI与EMBL检索有关茶树的EST序列，同时辅以EST-trimmer、CAP3和SSRIT等程序予以处理，PCR引物则是利用PRIMER5.0程序来设计的。经过数据库检索发现，茶树的EST序列并不适合于SSR引物，按照此法我们也可选择亲近的茶树EST-SSR引物。

定位查找genebank内的茶树EST序列，我们可以查找到20条符合要求的茶树EST序列，然后采用SSRhunter程序予以分析与处理，并未找到符合SSR引物设计要求的茶树EST序列，因而利用茶树EST序列来设计SSR引物可实现验证其通用性的目的。刘春燕、王艳芳等人按照已公布于世NCBI的茶树EST序列信息，利用EST-trimmer程序对其予以筛选，并采取CP3程序对序列片段予以分析与聚类，得到品质较高的Unigene，然后利用MISA程序再行处理得到40对EST引物。借助此40对EST引物作试验分析，并以重复基序在茶树出现的频率、GC含量约为50%左右、退火温度约58℃左右、序列片段长约200bp左右和EST引物长约20bp作为基本标准，筛选出28对执行下一步试验有价值的EST引物。

对以上筛选出的28对EST引物，记录其分子标记的PCR扩增效果，按照不同的扩增率依上而下分别将其赋值记为“0”，有条带的则将赋值记为“1”。统一构建EST-SSR引物的“0-1”数据表，以矩阵形式转化不同分析程序相应数据格式并予以严格分析。然后，利用POPGENE32、POWERMARKER V3.25对等位基因数（A）、有效等位基因数（Ne）、等位基因频率（P）、平均基因多态性和多态信息含量（PIC）等物种遗传多样性参数和物种遗传距离指标予以运算，得出计算结果。

3 EST-SSR茶树分子标记试验的结果分析

按照Lewers针对分子生物学的理论研究成果来看，EST-SSR引物的设计于SSR长度的要求较高，其长度于EST-SSR引物在不同物种之间多态性的效率息息相关。我们将SSR长度设定在18bp左右，目的便是为了增强EST-SSR引物扩增的多态性。因此，从40对EST-SSR引物中筛选出28对，均要求其长度在12bp～22bp范围以内。其中，13对具有二核苷酸重复基序，经电泳鉴定具备多态性的则为3对；15对具有三核苷酸重复基序，经电泳鉴定具备多态性的则为10对。这样的结果与刘春燕2010年所做试验的结果基本相同。经本次试验证明，28对EST-SSR引物可扩展的多达24对，且其中13 对EST-SSR引物附特异性扩增产物并具有良好的多态性特征。

上述EST-SSR引物附特异性扩增产物，其多态性特征的表现则为茶树间条带的差异性，这也说明了茶树之间的物种差异性。大部分EST-SSR引物的重复基序都大于18bp，总体通用率高达46.4%，较之黑莓、甜瓜和鲤鱼等物种要高的多。另外，对PCR产物检测可发现，共计得到81条条带，其扩增片段均保持在300bp左右。每对ESTSSR引物的扩增条带数目少则2条，多则14条。

本论文基于前人研究成果，精心筛选28对茶树的EST-SSR引物，并对其中17个茶树全基因组DNA加以扩增与鉴定，并成功扩增其中24对EST-SSR引物，占据总数约为85.7%，而成功扩增的ESTSSR引物又有13对可作为有效通用引物，通用率高达46.4%。

4 结束语

本文基于EST-SSR分子标记技术研究茶树分子生物学特征（物种通用性），着眼分子生物学对江西地区茶树予以种类分析与聚类分析，建构系统树，比较物种亲疏关系，并揭示江西地区茶树的物种遗传性状的构造、进化过程和种质资源情况。同时，改善我国在茶树分子标记技术水平不高的现状，通过试验研究验证茶树EST-SSR引物的物种通用性特征，且说明EST-SSR技术比SSR技术优势明显，进而深入推广EST-SSR作为一种物种分子标记手段应该成为物种鉴别的第一选择。EST序列原因物种基因的表达过程，可反映出基因编码的信息特征和转录区的差异性，因而在茶树分子遗传多样性分析及其建构遗传连锁图、分子标记、筛选育种等研究皆可适用，以此推广EST-SSR分子标记技术作为茶树分子生物学研究的基本理论和可靠依据。

参考文献

［1］张亚丽，赵丽萍，马春雷，等.茶树亲环素基因cDNA全长的分析鉴定与原核表达［J］.茶叶科学，2011，27（2）：112-114.

［2］阮宏鹏.复方丹参滴丸联合氨茶碱预防急性轻症高原病［J］.茶叶科学，2010，12（9）：76-79.

［3］傅海平，张亚莲，常硕其，等.湖南省茶叶研究所茶园土壤养分现状及20余年变化研究［D］.2009.

［4］戴前颖，夏涛，朱博，等.β-环糊精对茶汤体系的动力学稳定性影响［J］.茶叶科学，2012，11（15）：82-84.

［5］朱林，江昌俊，叶爱华，等.茶树ATP硫化酶和硒半胱氨酸甲基转移酶基因植物表达载体的构建［J］.茶叶科学，2010，3（22）：59-64.

作者简介：冯素萍（1972-），女，河南汝州人，博士，副教授，研究方向：花生生理及分子生物学研究。