貉源犬巴氏杆菌的分离与鉴定

芮　萍，马增军*，郭　刚，项　方，刘曜综

(1.河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室 河北秦皇岛 066600；2. 昌黎县畜牧发展局,河北昌黎 066000)



貉源犬巴氏杆菌的分离与鉴定

芮萍1，马增军1*，郭刚2，项方2，刘曜综1

(1.河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室 河北秦皇岛 066600；2. 昌黎县畜牧发展局,河北昌黎 066000)

摘要:为查明7日龄～10日龄仔貉急性死亡的主要病因，无菌采集仔貉的肺脏、脾脏、肝脏及肾脏组织，进行病原的分离培养，对分离菌株进行形态特征、培养特性、生化特性观察，初步表明分离菌株为犬巴氏杆菌。择优势菌株进行了16 S rRNA基因的 PCR 检测，基因序列分析表明，所检菌株16 S rRNA基因序列与犬巴氏杆菌的同源性在97.8%～100%，在进化树位于一个相对独立的分支。人工感染试验证实分离菌株对小鼠有强致病性。药敏试验显示分离菌株对青霉素类、头孢菌素类、氟喹诺酮类敏感，对链霉素、四环素、土霉素、磺胺嘧啶钠耐药。

关键词:貉；犬巴氏杆菌；分离；生物学特性；16 S rRNA

巴氏杆菌属的细菌是一种小的革兰阴性杆菌或球杆菌，大量定居在哺乳动物和鸟类上呼吸道和消化道黏膜表面，并产生致病作用。许多种属细菌作为原发性或条件性致病菌，可引起养殖业严重的经济损失。如多杀性巴氏杆菌是畜禽出血性败血症和传染性肺炎的主要病原菌，溶血性巴氏杆菌可致牛、羊、猪的肺炎、乳房炎和败血症。犬巴氏杆菌存在于狗、猫等动物的口腔中，可以通过咬人后感染人的伤口，引起腹膜炎、眼结膜炎、骨关节炎[1-3]等。也有报道犬巴氏杆菌可以引起幼驹的多发性关节炎[4]。犬巴斯德菌生物型1型引起新生幼犬的全身性感染[5]。关于犬巴氏杆菌引起家养貉发生全身败血症的病例未见报道，昌黎某养貉场发生仔貉以发病急，死亡快为主要特征的疾病，在饲养的25窝仔貉，其中9窝仔貉10日龄内全部急性死亡，剖检呈全身败血症变化，经病原鉴定，以及16 S rRNA基因序列分析，确诊为犬巴氏杆菌引起疾病，为该病的防控提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病料来源2014年秦皇岛昌黎某貉场的新生仔貉，临诊上表现为7日龄～10日龄的仔貉发病急、死亡快，病死率达到100%，肺表面有大量出血点，肝脏淤血肿大，表面有灰白色坏死灶；肾肿大呈灰黄色，表面有密集出血点；肠系膜淋巴结出血肿大，切面多汁。无菌采集肺脏、肝脏、肾脏、脾脏进行细菌分离鉴定。

1.1.2主要试剂ID32E肠道菌鉴定试条(产品编号：32400)为法国梅里埃公司产品;DNA Marker DL 2000 、2×EsTaqMasterMix为北京赛百盛基因技术有限公司产品。

1.1.3实验动物试验所用小鼠为Balb/c小鼠，约25 g，由河北科技师范学院实验动物中心提供。

1.2方法

1.2.1病原分离纯化及生化特性鉴定无菌采取病死仔貉肝、肺、脾、肾等器官组织，划线接种于鲜血琼脂平板、普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板，37 ℃恒温培养18 h~24 h，选取圆形、透明、露珠样优势生长菌落移接于改良马丁肉汤进行纯培养供鉴定用。挑取上述纯培养菌落抹片，分别进行革兰染色和美蓝染色，镜检。分离菌经鲜血琼脂纯培养24 h后，分别用ID32E肠道菌鉴定试剂条进行糖发酵及其他生化试验，具体方法依据说明书进行。

1.2.2致病性试验将分离菌株接种改良马丁肉汤，37 ℃恒温培养18 h，用生理盐水稀释菌数约为109CFU/mL，腹腔注射4只小鼠，0.2 mL/只；同时设生理盐水阴性对照。接种后观察发病及死亡情况，对死亡小鼠进行剖检，观察组织病变，同时采集肝、脾、肺进行细菌分离培养。

1.2.3药敏试验按照美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的标准K-B纸片法进行试验操作和结果判断[7]。

1.2.416 S rRNA基因序列测定16 S rRNA基因序列PCR扩增的2个通用引物27F和 1492R由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以小量细菌基因组DNA抽提试剂盒提取的细菌基因组为模板进行PCR扩增，反应体系(25 μL)：2×EsTaqMasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 8.5 μL，DNA模板2.0 μL。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 1 min ，45 ℃ 2 min，72 ℃ min，30个循环；72 ℃再延伸6 min。取出3 μL扩增产物于10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 系统进化树分析PCR扩增产物经纯化后送上海生工进行序列测定，利用DNA Star 软件对16 S rRNA基因进行序列分析，同时使用MegAlign软件与从GenBank数据库中获得的序列相似性较高的菌株序列进行比对，构建系统发育树。

2结果

2.1分离培养和镜检结果

无菌取肝脏、肺脏、肾脏、脾脏组织，经鲜血琼脂平板培养生长良好，呈均一的露珠大小、表面光滑、边缘整齐、淡灰白色、不溶血的菌落；在普通营养琼脂培养基上生长贫瘠，形成针尖大小、淡灰白色菌落；在麦康凯培养基上不生长。革兰染色镜检为革兰氏阴性短小杆菌，美蓝染色见两极浓染球杆菌。

2.2生化试验结果

4株分离菌触酶和氧化酶试验为阳性，经NEW ATB微生物鉴定分析系统检测，鉴定结果见表1。

表1　分离菌的生化特性

注：“+”为阳性，“-”为阴性。

Note："+" positive，"-"negative.

2.3致病性试验结果

试验组小白鼠24 h内全部发病死亡。剖检死亡小白鼠可见皮下有不同程度的瘀血、出血；肝、肺、肾有出血点和出血斑，脾肿大淤血。无菌采集死亡小鼠病变脏器接种于鲜血琼脂平板，培养24 h后分离获得纯的病原细菌。挑取单个菌落革兰染色后镜检，可见与接种菌一致的病原细菌。对照组小白鼠健康存活，剖检各脏器无异常现象。试验结果证实分离菌株对小鼠有致病性。

2.4药敏试验结果

分离菌株对青霉素、阿莫西林、头孢拉定、头孢噻呋、头孢氨苄、阿米卡星、氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、磺胺嘧啶钠敏感，对链霉素、四环素、土霉素耐药。

2.516 S rRNA基因序列测定与系统发育学

将分离的病原菌(编号:p0140501)进行16 S rRNA基因序列测定，所扩增的基因序列长度为1 441 bp(图1)，获得的基因序列提交GenBank(登录号: KM079615)。将分离菌株的16 S rRNA基因序列在NCBI网站进行BLAST搜索比对，择取部分菌株进行系统发育学分析，并构建系统进化树(图2)。进化树整体上分为四大分支，分离菌株与犬巴氏杆菌亲缘关系较近聚为一支。经同源性分析(图3)，分离菌株的16 S rRNA基因与犬巴氏杆菌同源性分别在98.9%～100%。与口腔巴氏杆菌的同源性在97.1%，与肺炎巴氏杆菌的同源性为97.9%，与多杀巴氏杆菌的的同源性在97.8%~97.9%。

M. DNA标准DL 2 000;1~4. 分离自肝、脾、肺、肾菌株的PCR产物

M. DNA Maker DL 2 000；1-4. PCR products of positive strains from liver,spleen,lung and kidney

图1分离菌16 S rRNA基因的PCR扩增

Fig.1PCR results of 16 S rRNA gene fromS.suis

3讨论

昌黎某养貉场发生仔貉以发病急，死亡快为主要特征的疾病，剖检呈全身败血症变化，从病变组织中分离获得4株细菌。从形态特征、培养特性分析，初步证明分离菌株为巴氏杆菌。采用16 S rRNA基因序列测定与系统发育学分析，进一步证实其为犬巴氏杆菌，且分离菌株能产生靛基质，属于生物1型。通过人工感染试验，证明分离菌株具有一定致病性。为该病的预防、控制和临床治疗提供指导。

图2　16 S rRNA基因进化分析

图3　16 S rRNA基因的核苷酸序列同源性比较

对供试4株菌的理化性状鉴定结果显示，有个别生化特性的结果与《Bergey's Manual of Systematic Bacteriology》第2版(2009)[6]中不一致，如葡萄糖、蔗糖；但通过16 S rRNA基因序列测定的发育学分析，与犬巴氏杆菌具有98.9%～100%的同源性。因此认为，在对犬巴氏杆菌进行鉴定时，除了形态特征、理化特性等表观分类学的传统分类鉴定外，最好结合16 S rRNA等分子分类鉴定，以准确进行菌种的判定。

犬巴氏杆菌包括2个生物型，犬巴斯德菌生物型1型存在于狗、猫等动物的口腔中，可以通过咬人后感染人的伤口，引起腹膜炎、眼结膜炎、骨关节炎等，因此常在狗咬人的感染人伤口中分离到此菌。生物2型菌株多分离于肺炎牛的病变肺。本文首次从全身败血症感染仔貉组织中分离到犬巴氏杆菌生物型1型菌株，与文献[5]报道犬巴氏杆菌生物型1型引起新生幼犬的全身性感染相一致。近年来，随着毛皮动物饲养规模不断扩大，养殖环境污染严重，圈舍拥挤通风不良的、冷热交替、气候骤变等诱因，均可使仔貉抵抗力降低，给致病菌的入侵提供了机会。因此，本文将为有效诊断和防治毛皮动物疾病提供指导意义。

药敏测定结果显示，分离菌株对青霉素、阿莫西林、头孢拉定、头孢噻呋、头孢氨苄、阿米卡星、氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、磺胺嘧啶钠敏感，对链霉素、四环素、土霉素耐药。该结果有益于选择用药防治由犬巴氏杆菌引起的感染症。考虑到细菌耐药变迁，条件许可最好对分离菌株进行药敏测定后选择敏感药物为宜。

参考文献:

[1]Castellano I, Marín JP, Gallego S, et al.Pasteurellacanisperitonitis in a peritoneal dialysis patient[J]. Perit Dial Int, 2011,31(4):503-504.

[2]Rashid N K, Zam Z, Mdnoor S S, et al.Pasteurellacanisisolation following penetrating eye injury[J]. Case Rep Ophthalmol Med,2012,2012:1-3.

[3]Hazelton B J, Axt M W, Jones C A.Pasteurellacanisosteoarticular infections in childhood: review of bone and joint infections

due to pasteurella species over 10 years at a tertiary pediatric hospital and in the literature[J]. J Pediatr Orthop, 2013, 33(3): 34-38.

[4]Bourgault A, Bada R, Messier S. Isolation ofPasteurellacanisfrom a foal with polyarthritis[J]. Can Vet J,1994, 35(4):244-245

[5]de la Puente Redondo V A, Gutiérrez Martín C B, García del Blanco N, et al. Systemic infection byPasteurellacanisbiotype 1 in newborn puppies[J]. J Comp Pathol, 2000, 123(2-3): 195-197.

[6]Garrity G M. Bergey's manual of systematic bacteriology[M]. Second edition.Volume TWO. Springer，New York, 2009:857-866.

Isolation and Identification ofPasteurellacanisfrom Raccoon Dogs

RUI Ping1, MA Zeng-jun1,GUO Gang2, XIANG Fang2, LIU Yao-zong1

(1.KeyLaboratoryofPerventiveVeterinaryMedicineofHebei,HebeiNormalUniversityofScicineandTechnology,Qinhuangdao,Hebei, 066000,China；2.ChangliAnimalHusbandryBureaue,Changli,Hebei, 066600,China)

Abstract:Four pathogenic strains were isolated from lungs, spleen, liver and kidney of the infected 7-10 days old aberdeen raccoon by routine bacterial isolation, identification technologies. The pathogen was identified as Pasteurella multocida based on its morphology, culture characteristics, biochemical characteristics and 16S rRNA gene PCR results. Sequence alignments indicated that 16 S rRNA gene from the isolates shared 97.8%-100% identity with Pasteurella canis in GenBank and located in a relatively independent branch. Artificial infection experiment confirmed that the isolates were pathogenic. The result of drugs sensitivity test showed that the isolates were highly sensetive to penicillin, cephalosporins and fluoroquinolones, resistant to streptomycin, tetracycline, oxytetracycline and sulfadiazine sodium. This represents the first report of systemic pasteurellosis caused by P. canis in raccoon dogs.

Key words:raccoon dog; Pasteurella canis; isolation; physiological characteristic; 16 S rRNA

文章编号:1007-5038(2016)02-0125-04

中图分类号:S852.612

文献标识码:B

作者简介：芮萍(1969-)，女，河北张北人，教授，博士，主要从事兽医病原微生物学及药理学研究。*通讯作者

基金项目：河北省科技支撑项目(13226609D)；河北省畜牧局计划项目(2011-1-19)

收稿日期：2015-06-12