新型脑白质病变动物模型及其脑小血管的病理学研究

林晶王迪龙邱宝山范玉华

·论 著·

新型脑白质病变动物模型及其脑小血管的病理学研究

林晶*王迪龙*邱宝山*范玉华*

目的 建立一个新型的具有高血压及脑小血管病理改变的脑白质病变（white matter lesions，WMLs）动物模型。方法 13只雄性Sprague-Dawley大鼠，随机分为假手术组（n=6）与易卒中型肾血管性高血压-改良的2VO组（stroke-prone renovascular hypertensive rat-modified 2 vessel occlusion RHRSP/Modified 2VO）（n=7），RHRSP/Modified 2VO组先行双肾双夹术制作RHRSP模型，12周后间隔1周先后夹闭双侧颈总动脉。双肾双夹术后20周对大鼠进行水迷宫试验观察大鼠是否存在空间记忆功能的受损，组织病理学检测观察是否存在脑白质病变及相应的脑小血管病理学改变。结果 双肾双夹术后12周，RHRSP/Modified 2VO组7只大鼠收缩压均大于180 mmHg；水迷宫实验：RHRSP/Modified 2VO组的逃避潜伏期较假手术组明显升高（P＜0.05），穿越平台次数及原平台象限停留时间比较假手术组明显降低[(2.5±1.05 vs.5±1.67);(28.04%±14.13%vs.49.69%±13.12%)]，差异具有统计学意义（P＜0.05）；RHRSP/Modified 2VO组脑白质病变的分级明显高于假手术组(2.17±0.75 vs.0.33± 0.52)，差异具有统计学意义（P＜0.05），且RHRSP/Modified 2VO大鼠存在脑小血管的病理改变（小动脉管壁增厚、血脑屏障破坏及静脉胶原沉积）。结论 RHRSP/Modified 2VO是适用的WMLs动物模型，可用于探究WMLs的发病机制及治疗靶点。

新型动物模型 脑白质病变 脑小血管 高血压 大鼠

脑白质病变（white matter lesions,WMLs）也称为脑白质疏松（leukoaraiosis,LA），是脑小血管病的一种主要亚型，主要表现为核磁共振T2及FLAIR像高信号。WMLs的病理特点以髓鞘苍白脱失、少突胶质细胞凋亡及空泡形成为主[1]，临床上常常表现为认知功能减退、痴呆、步态异常及小便失禁[2-5]，目前WMLs的发病机制暂不清楚，可能与血管解剖学因素、脑血流自动调节功能受损、静脉胶原病等因素相关[6-8]。目前用于研究WMLs的动物模型主要有两种—两血管阻断法（2-vessel occlusion,2VO）动物模型及易卒中型自发性高血压模型（stroke-prone spontaneously hypertensive rat, SHRSP)动物模型[9-10]。易卒中型肾血管性高血压模型（stroke-prone renovascular hypertensive rat, RHRSP)通过双肾双夹术能产生稳定的高血压[11]。各种WMLs动物模型都存在相应的优缺点，本研究试图建立一个新型合适的WMLs动物模型—易卒中型肾血管性高血压-改良的2VO（stroke-prone renovascular hypertensive rat-modi⁃fied 2 vessel occlusion,RHRSP-Modified 2VO），并且对其脑小血管进行病理学研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 13只健康雄性Sprague-Dawley大鼠（广东省实验动物中心），体质量约80 g～90 g。所有大鼠均饲养于中山大学北校区实验动物中心（SPF级环境），随机分为假手术组（n=6）和RHRSP/ Modified 2VO组（n=7），实验过程全部遵循科技部《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 RHRSP/Modified 2VO模型制作及血压测量

RHRSP/Modified 2VO组按照双肾双夹术[11]制定RHRSP动物模型，假手术组除了未钳夹肾动脉其

他操作与RHRSP/Modified 2VO组一致；12周后用ML866 Powerlab 4/30型大鼠血压计（AD Instru⁃ments Pty Ltd，澳大利亚）经尾动脉测定收缩压，收缩压超过180 mmHg定义为RHRSP造模成功。RHRSP模型成功的大鼠先进行右侧颈总动脉夹闭（5-0缝合丝线结扎两侧然后中间剪断颈总动脉），1周后同样方式夹闭左侧颈总动脉，假手术组除了不夹闭颈总动脉余操作一样。

1.3 水迷宫实验双侧颈总动脉均夹闭后8周进行Morris水迷宫实验[12]，大鼠于实验前1天在池中自行游泳180 s以适应水温和环境，第1～5天为定位航行试验（III象限中间放置平台，大鼠按4个入水点顺序放入水池，每只大鼠入水顺序相同，入水开始至登入平台为逃避潜伏期，如果60 s未找到平台则引导其登入平台，此时记录为60 s），以每天四个入水点的逃避潜伏期均数记录为每天的逃避潜伏期；第6天为空间搜索试验，撤掉平台，记录60 s穿越平台次数及停留于III象限的时间比。

1.4 脑组织准备及组织病理学评价水迷宫实验结束后，所有大鼠应用4%多聚甲醛经心脏灌注取脑，4%多聚甲醛后固定24 h，随后于嗅球后方1.5 mm处取4 mm厚脑组织，石蜡包埋，冠状面连续切片（片厚3µm）。

1.4.1 HE染色 石蜡切片脱腊后染苏木素3 min，盐酸乙醇分化，伊红40 s，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜观察40～100µm小动脉形态。

1.4.2 Luxol fast blue（LFB）染色 每只大鼠取同一层面进行LFB染色：石蜡切片脱腊后，再放入0.1%LFB染液于60度烘箱过夜，95%乙醇洗去过染的脑片，先后入0.05%碳酸锂及70%乙醇分化，随后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在光学显微镜下观察，参照Wakita H等[6]分级方法对WMLs进行分级：0级，正常；1级，神经纤维结构紊乱；2级，明显空泡形成；3级，有髓神经纤维消失。

1.4.3 Masson三色染色 石蜡切片脱腊至水，按照Masson三色染色试剂盒（Baso）进行染色，中性树胶封片，光学显微镜观察是否存在静脉胶原沉积及部位。

1.4.4 免疫组化 取石蜡切片进行免疫组化检测，一抗为小鼠抗大鼠MBP（1:300，Abcam），4度孵育16 h，加入二抗（1：100抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂）孵育1 h，随后DAB显色及苏木素染核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.4.5 免疫荧光 石蜡切片脱腊后进行免疫荧光，一抗为山羊抗大鼠Albumin（1:200，SANTA），4度孵育16h，加入驴抗山羊荧光二抗（1:500，Jack⁃son），DAPI封片剂封片，荧光显微镜观察。

1.5 统计学方法采用SPSS20.0进行统计分析，光密度及面积使用Image-Pro Plus进行测量，计量数据均以（±s）表示。水迷宫实验逃避潜伏期使用重复测量设计方差分析，WMLs分级使用Mann-Whitney U检验，其余数据满足正态性及方差齐性情况下组间比较使用t检验，检验水准α= 0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 血压测量结果测量双肾双夹手术前基础血压及术后12周血压，术前基础血压：RHRSP/Modi⁃fied 2VO组较假手术组血压差异无统计学意义(114.46±5.68 vs.108.95±7.05，t=1.562，P=0.147）；术后12周血压：RHRSP/Modified 2VO组血压较假手术组明显升高，差异有统计学意义（218.76±23.61 vs.126.83±7.38，t=9.759，P=0.000），且RHRSP/Modi⁃fied 2VO组7只大鼠收缩压均＞180 mmHg。

2.2 死亡率假手术组6只大鼠全部存活，RHRSP/ Modified 2VO组1只大鼠在左侧颈总动脉夹闭后2天死亡，其余6只RHRSP/Modified 2VO组大鼠存活。

2.3 水迷宫实验前5天定位航行试验显示，两组逃避潜伏期均逐渐递减（图1D）。第1天逃避潜伏期，假手术组与RHRSP/Modified 2VO组差异无统计学意义，第2～5天逃避潜伏期，RHRSP/Modi⁃fied 2VO组均大于假手术组，且差异有统计学意义（P＜0.05）。第6天空间探索试验显示，穿越平台次数RHRSP/Modified 2VO组（2.5±1.05）明显小于假手术组（5±1.67），差异有统计学意义（P＜0.05）；原平台象限停留时间比，RHRSP/Modified 2VO组（28.04±14.13%）明显小于假手术组（49.69± 13.12%），差异有统计学意义（P＜0.05）（图1C）。

2.4 Luxol fast blue染色与假手术组相比，RHRSP/Modified 2VO组白质出现神经纤维出现疏松、弥散性空泡形成及有髓神经纤维的消失（图2），WMLs分级显示，RHRSP/Modified 2VO组（2.17±0.75）分级显著高于假手术组（0.33±0.52），具有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 MBP免疫组化MBP免疫组化显示：RHRSP/ Modified 2VO组MBP染色紊乱且出现不着色的空泡，假手术组MBP染色致密均匀（图3）；RHRSP/ Modified 2VO组平均光密度（IOD/um2）（0.05±0.01）明显低于假手术组（0.08±0.01），有统计学意义（P＜0.05）（图3 E）。

图1 水迷宫实验：A,B分别为RHRSP/Modified 2VO组与假手术组空间探索试验轨迹，小圈为原平台，III象限为原平台所在象限，RHRSP/Modified 2VO组穿越平台次数及原平台象限停留时间比均小于假手术组；C为空间探索试验穿越平台次数及原平台象限停留时间比；D为定位航行试验逃避潜伏期；*与假手术组相比，P＜0.05

2.6 脑小血管的病理改变—小动脉HE染色、白蛋白（Albumin）免疫荧光及Masson三色染色 脑小血管（40～100µm）HE染色示：RHRSP/Modified 2VO组存在管壁增厚、管腔狭窄，而假手术组管壁无明显增厚（图4）；血脑屏障（Blood Brain Barrier BBB）破坏后继发的白蛋白渗漏免疫荧光示：RHRSP/Modified 2VO组较假手术组明显增多，且在脑白质病变部位（图4）；Masson三色染色示：RHRSP/Modified 2VO组白质区域存在静脉胶原沉积，而假手术组无静脉胶原沉积（图4）。

3 讨论

我们的研究发现RHRSP/Modified 2VO动物模型存在脑白质病变，并且伴随脑小血管病最常见的危险因素（高血压）、小血管的病理改变（小动脉管壁增厚，BBB破坏及静脉胶原沉积）及空间记忆功能的受损。提示RHRSP/Modified 2VO是合适的脑白质病变动物模型。

我们的研究采用Modified 2VO是为了克服传统的2VO动物模型出现强烈的急性缺血引起死亡率过高的问题；2VO动物模型双侧颈总动脉夹闭后血流量下降55%～70%，维持2～3 d后进入慢性缺血期，大鼠死亡多见于急性缺血阶段[13]；Fujishi⁃ma等[14]研究发现在高血压基础的2VO死亡率（72%，78/108）比正常血压基础的2VO死亡率（16%，7/43）显著增高；我们在高血压的基础上选择Modified 2VO并没有明显增加死亡率。传统的2VO动物模型存在脑白质病变，但与人产生脑白质病变的过程相差甚远，因为2VO动物模型缺乏脑小血管病的危险因素及相应的小血管病理改变；RHRSP/Modified 2VO存在最常见的危险因素高血压且有脑小血管的病理学改变（小动脉管壁增厚，BBB破坏及静脉胶原沉积）。但RHRSP/ Modified 2VO小动脉管壁增厚程度并不是非常严重而且部位局限，这可能是由于功能受损先于形态学改变，有研究表明长期高血压在脑小血管形态学出现改变之前已经存在内皮的功能受损，从而影响2VO后的侧支循环开放继而引起脑白质病变[15,16]。后期的研究将探究该模型是否存在内皮细胞功能的受损，为后期的干预靶点提供基础。

图2 LFB染色：A,B分别为RHRSP/Modified 2VO组LFB染色的大体图及相对应的高倍镜图（400×）；C,D分别为假手术组LFB染色的大体图及相对应的高倍镜图（400×）；箭头所指为空泡

图3 MBP免疫组化：A,B分别为RHRSP/Modified 2VO组胼胝体及尾状核MBP免疫组化染色（200×），C,D分别为假手术组胼胝体及尾状核MBP免疫组化染色（200×）；A,B示RHRSP/Modified 2VO组胼胝体及尾状核出现纤维紊乱及空泡，而C,D示假手术组纤维致密均匀；箭头所指为空泡；E为MBP平均光密度统计图，*与假手术组相比，P＜0.05

图4 HE染色、白蛋白免疫荧光及Masson三色染色：A,D分别为RHRSP/Modified 2VO组及假手术组HE染色（400×），RHRSP/Mod⁃ified 2V0组存在管壁增厚、管腔狭窄，bar=50um；B,E分别为RHRSP/Modified 2VO组及假手术组Albumin免疫荧光（200×），RHRSP/Modified 2VO组较假手术组白蛋白渗漏明显增多；C,F分别为RHRSP/Modified 2VO组及假手术组Masson三色染色（200×），RHRSP/Modified 2VO组存在静脉胶原沉积，bar=100um

这个新的WMLs动物模型（RHRSP/Modified 2VO）包含了脑血管病最常见的因素高血压并且存在高血压导致的脑小血管病理改变，既可以用于研究脑小血管原发的病理生理改变，也可以用于探索继发的脑实质病变，而传统的2VO无法探究高血压导致的脑小血管结构与功能的变化。本研究也存在一定的局限性，RHRSP/Modified 2VO大鼠病变程度不同（包括WMLs的分级及病变范围），且有1只大鼠WMLs分级只有1级，这可能与造模时间太短存在相关性，后期的研究可延长造模时间从而增加模型的稳定性。

因此，我们这种新型的动物模型（RHRSP/ Modified 2VO）是适用的WMLs动物模型，可用于探究WMLs的发病机制及治疗靶点。

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Establishment of a novel animal model for white matter lesions and its pathological study of cerebral smallvessels.

LIN Jing,WANG Dilong,QIU Baoshan,FAN Yuhua.Department of Neurology,First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,National Key Clinical Department,National Key Discipline,Guangdong Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Major Neurological Diseases(2014B030301035),Guangzhou 510080,China.Tel：020-87332200.

Objective To establish a novel white matter lesions(WMLs)animal model with hypertension and to ex⁃amine its pathological changes of cerebral small vessels.Methods Thirteen male Sprague-Dawley rats were randomly di⁃vided into sham operation group(n=6)and stroke-prone renovascular hypertensive rat-modified 2 vessel occlusion group (RHRSP/Modified 2VO)(n=7).RHRSP/Modified 2VO group was induced by the two-kidney two clip method first and un⁃derwent the operation of modified bilateral common carotid artery occlusion(1 week interval)12 weeks later.Morris wa⁃ter maze test was used to detect spatial memory function and pathology test was used to investigate white matter lesions and the cerebral small vessels after 20 weeks of two-kidney two clip operation.Results Twelve weeks after two-kidney two clip operation,the blood pressure was more than 180mmHg in all RHRSP/Modified 2VO.Morris water maze test showed that escape latencies was significantly higher in RHRSP/Modified 2VO group than in the sham operation group(P＜0.05).The number of crossing hidden platform as well as time ratio in the target quadrant of were significantly shorter in the RHRSP/Modified 2VO group than in sham operation group[(2.5±1.05 vs.5±1.67);(28.04±14.13%vs.49.69± 13.12%)](P＜0.05).Compared to sham operation group,RHRSP/Modified 2VO group had a higher grade of WMLs(2.17± 0.75 vs.0.33±0.52)(P＜0.05)and exhibited the pathological changes of cerebral small vessels including small artery wall thickening,BBB disruption and venous collagen deposition.Conclusions RHRSP/Modified 2VO can be regarded as ap⁃propriate WMLs animal model and may therefore be adapted to explore pathogenesis and possible treatments for WMLs.

Novel animal model White matter lesions(WMLs)Cerebral small vessels Hypertension Rat

R743.3

A

2016-09-26）

（责任编辑:李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.11.008

☆ 广东省科技计划项目（编号：2015A030302013）

* 中山大学附属第一医院神经科，国家临床重点专科，广东省重大神经疾病诊治研究重点实验室（2014B030301035）（广州 510080）

E-mail：fansusan@126.com）