哺乳期使用氟西汀对子代大鼠行为学及5-羟色胺转运体和色氨酸羟化酶影响研究

成熟陈茉弦蒋玲雷蕾周娅陈倩敖丽娟

·论 著·

哺乳期使用氟西汀对子代大鼠行为学及5-羟色胺转运体和色氨酸羟化酶影响研究

成熟*陈茉弦△蒋玲※雷蕾◎周娅◎陈倩◎敖丽娟△

目的观察哺乳期使用氟西汀对子代大鼠行为学及5-羟色胺转运体（serotonin transporter，SERT）和色氨酸羟化酶（tryptophan hydroxylase，TPH）蛋白的影响。方法妊娠SD大鼠随机分为2组，每组各3只。待分娩后5～21 d予以实验组母鼠腹腔注射氟西汀（12 mg/kg），对照组母鼠腹腔注射等量生理盐水，期间正常哺乳，第21 d断奶。每只母鼠的子代中各挑选8只，婴儿期不同时间点分别测量体重、毛发、睁眼以评价生长发育，听觉、埋藏食物小球和自由悬挂实验评价其神经反射和运动行为；儿童期和青年期（出生后35 d和75 d）分别取实验组和对照组子代大鼠各6只，取脑组织行免疫组织化学染色检测前额皮质SERT及TPH水平。结果婴儿期氟西汀组子代大鼠体重较对照组低（P＜0.05），听觉敏感性得分较对照组高（P＜0.01），自由悬挂实验时间较对照组短（P＜0.01）。儿童期和青年期时氟西汀组子代前额皮质SERT及TPH均较对照组降低（P＜0.05）。结论哺乳期母鼠暴露于氟西汀可能通过下调子代大鼠前额皮质SERT和TPH导致其发育和行为异常。

哺乳期 氟西汀 行为学 5-羟色胺转运体 色氨酸羟化酶

社会节奏的加快使产后抑郁现象迅速增多，国内报道产后抑郁的发生率为23.08%[1]，而在年轻的未婚妈妈当中可以达到26%[2]。新生儿在哺乳期暴露于抗抑郁药可能会影响其发育[3-4]，引起中枢神经系统及生理、代谢功能的永久性改变，使其在儿童或者成年期容易罹患孤独症。大量研究证实孤独症的发生与发育期高血5-羟色胺（5-hy⁃droxytryptamine，5-HT）相关[5]，而母体服用的5-羟色胺再摄取抑制剂（selective serotonin reuptake in⁃hibitor，SSRI）可通过乳汁排泄并透过婴儿血脑屏障[6]，通过与5-羟色胺转运体（serotonin transport⁃er，SERT）结合而抑制5-HT再摄取，从而提高5-HT在突触间隙的含量。本研究主要探究哺乳期使用抗抑郁药对子代行为学及SERT和5-HT合成限速酶色氨酸羟化酶（tryptophan hydroxylase，TPH）蛋白的影响，模拟临床发育期高血5-HT（de⁃velopmental hyperserotonemia，DHS）孤独症假说[7]，为孤独症的发病机制和哺乳期用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组实验用Sprague-Dawley雌性母鼠（昆明医科大学实验动物中心提供）6只，体重300～320 g，孕18 d。随机分为氟西汀组和对照组，每组3只母鼠。子代大鼠出生后，每只母鼠的子代中各挑选8只，5.5～6.5 g。氟西汀组母鼠在产后5～21 d（postpartum，P5～21）每天腹腔注射氟西汀12 mg/kg，对照组母鼠在产后P5～21每天腹腔注射等量生理盐水，期间正常哺乳。P21时仔鼠断奶，雌雄分笼饲养。所有大鼠及其子代饲养在温度22℃、湿度60%、12 h光:12 h暗（早6:00开灯，晚6:00关灯）的循环动物房中，自由饮水、进食。本研究通过昆明医科大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 生长发育、神经发射和运动行为评价

1.2.1 体重和毛发 在仔鼠婴儿期不同时间点（P9、P11、P13）于上午9:00称量体重，并用小镊子拔少许尾部的毛发，选择一根最长、硬度类似的毛发置于黑色硬纸板上，用游标卡尺测量毛发长度。

1.2.2 睁眼 于仔鼠婴儿期（P9、P11、P13）观察睁眼情况。评分依据：2分为两只眼睛均睁开；1分为1只眼睛睁开；0分为2只眼睛均未睁开。

1.2.3 听觉 在仔鼠婴儿期（P9、P11、P13）进行听觉检查。将每只仔鼠单独移至距一金属板垂直距离15 cm的平面上，在仔鼠平静无意识准备的情况下，在距金属板15 cm高处坠下一金属球，撞击金属板，发出强烈的声音以给予刺激。实验者观察仔鼠肌肉收缩或夹尾抽搐为阳性反应，连续2次刺激反应阳性为达标，达标计为1分，未达标计为0分。

1.2.4 自由悬挂实验 在仔鼠P11、P13时进行，将仔鼠前肢放在一固定水平位置的T型金属横杆上，横杆直径0.5 cm，距地面高度30 cm，待其前肢握住横杆后松手，实验者用秒表计时仔鼠抓握横杆悬挂的时间。

1.2.5 埋藏食物小球实验 仔鼠P26时进行埋藏食物小球实验以评价嗅觉发育。仔鼠被置于一个45 cm×24 cm×20 cm的无色透明测试笼中，笼内盛有3 cm深的干净垫料。将与1 g大鼠饲料同等体积的蛋糕埋藏于垫料下方0.5 cm处，用秒表计时仔鼠找到蛋糕时间，即从仔鼠被放入测试笼中开始，到揭开食物并用前爪或牙齿抓住食物的时间，仔鼠若在5 min内未找到食物，则计为5 min。仔鼠在测试之前禁食24 h，每只仔鼠测试结束，更换垫料防止留下气味线索。

1.3 前额皮质SERT和TPH检测

1.3.1 标本制备 于仔鼠儿童期和成年期，即P35和P75时分别从两组各取6只。将仔鼠称重并记录，配置浓度为5%水合氯醛麻醉大鼠，待大鼠麻醉后（四肢无肌张力）开始大脑灌注固定。取脑时从延髓开始，慢慢分离颅底组织。将所取脑组织放入盛有4%多聚甲醛溶液中，4℃冰箱保存24 h，然后将脑标本放入15%和30%蔗糖溶液进行梯度脱水，直至标本漂浮起来。脱水完成后，OTC包埋剂包埋置于-80℃，冷却后取出切片（厚约10 μm），放置于-20℃保存待用。

1.3.2 免疫组化检测 取出待用切片，PBS洗涤5 min 3次，室温下3%H2O2封闭15 min除去内源性的过氧化氢酶，PBS洗涤，室温下血清封闭1 h，4℃下一抗（兔抗SERT和TPH抗体，Abcam公司）孵育过夜，PBS洗涤，室温下二抗孵育1 h，PBS洗涤，显色剂避光显色5 min，蒸馏水洗涤终止反应，酒精和二甲苯梯度脱水后用中性树胶封片。免疫组化染色后阳性结果呈黄色或棕黄色。在高倍镜（10× 40）下，随机选择5个高倍视野，每个视野计数1000个细胞以上，计算阳性细胞比例。

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0进行统计分析。数据以均数±标准差（±s）表示，体重、毛发长度、睁眼评分、自由悬挂时间属于重复测量资料，使用重复测量方差分析进行统计分析，各时点上组间比较采用独立样本t检验。两组间埋藏食物小球实验时间及SERT和TPH的比较采用独立样本t检验。检验水准α为0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 仔鼠哺乳期生长发育情况

2.1.1 体重 仔鼠体重经重复测量方差分析示，时间主效应（F=5.89，P=0.02）、分组主效应（F=7.22，P=0.01）、时间与分组的交互效应（F=17.81，P＜0.01）均有统计学意义。在P9、P11、P13时，氟西汀组与对照组仔鼠体重差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.1.2 毛发 仔鼠毛发长度的时间主效应（F= 26.12，P＜0.01）、时间与分组的交互效应（F=13.13，P=0.02）有统计学意义，分组主效应无统计学意义（F=3.03，P=0.10）。P9和P11时两组间毛发长度无统计学差异（P＞0.05），P13时差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.1.3 睁眼 氟西汀组和对照组仔鼠在P9和P11时均未睁眼。P13时氟西汀组仔鼠睁眼程度与对照组相比无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

2.2 仔鼠哺乳期神经反射及运动功能

2.2.1 听觉 仔鼠听觉评分的时间主效应（F=8.00，P=0.01）、分组主效应（F=8.03，P=0.01）、时间与分组的交互效应（F=8.14，P=0.01）均有统计学意义。氟西汀组仔鼠听觉得分在P9和P11时高于对照组（P＜0.01），在P13时两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 不同时间点氟西汀组与对照组仔鼠生长发育和神经反射及运动发育情况（±s）

表1 不同时间点氟西汀组与对照组仔鼠生长发育和神经反射及运动发育情况（±s）

1）重复测量方差分析后，与对照组相比较，经独立样本t检验，P＜0.05；2）重复测量方差分析后，与对照组相比较，经独立样本t检验，P＜0.01

P11 n 体重（g）组别氟西汀组对照组毛发长度（mm）P9 19.73±1.821)21.49±1.39 P11 20.81±2.041)22.94±1.36 P13 23.48±2.611)27.86±1.20 P9 2.34±0.48 2.68±0.39 P11 2.63±0.30 2.69±0.36 P13 3.50±0.571)4.87±0.70睁眼P9 24 24 00 00组别 听觉得分氟西汀组对照组睁眼P13 1.25±0.89 1.19±0.94 P9 0.67±0.492)0.13±0.35 P11 0.78±0.432)0.25±0.46 P13 0.88±0.33 0.98±0.23自由悬挂时间（s）P11 1.56±0.702)3.63±1.51 P13 2.9±1.062)5.00±2.45埋藏食物小球实验时间（s）P26 24.17±23.93 27.30±33.32

2.2.2 自由悬挂实验 仔鼠自由悬挂实验时间的时间主效应（F=22.41，P＜0.01）、分组主效应（F= 18.15，P＜0.01），时间主与分组的交互效应有统计学意义（F=12.17，P＜0.01）。P11和P13时氟西汀组仔鼠自由悬挂实验时间均较对照组减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

2.2.3 埋藏食物小球实验 P26氟西汀组仔鼠埋藏食物小球实验时间与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3 前额皮质SERT和TPH表达水平儿童期（P35）时，氟西汀组仔鼠前额皮质SERT（32.67%± 2.52%）表达低于对照组（49.33%±3.06%），差异有统计学意义（t=-10.30，P＜0.01），见图1；氟西汀组仔鼠前额皮质TPH（51.33%±3.06%）表达亦低于对照组（72.33%±9.61%），差异有统计学意义（t=-5.10，P＜0.01），见图2。待仔鼠生长发育至青年期（P75），氟西汀组仔鼠前额皮质SERT（14.32%±1.73%）表达低于对照组（36.12%± 2.18%），差异有统计学意义（t=-19.17，P＜0.01），见图3；氟西汀组仔鼠前额皮质TPH（39.26%± 3.45%）表达亦低于对照组（56.67%±8.42%），差异有统计学意义（t=-4.67，P＜0.01），见图4。

图1 氟西汀组和对照组仔鼠P35前额皮质SERT表达变化（40×）A为氟西汀组仔鼠前额皮质SERT的表达；B为对照组仔鼠前额皮质SERT的表达

图2 氟西汀组和对照组仔鼠P35前额皮质TPH表达变化（40×）A为氟西汀组仔鼠前额皮质TPH的表达；B为对照组仔鼠前额皮质TPH的表达

图3 氟西汀组和对照组仔鼠P75前额皮质SERT表达变化（40×）A为氟西汀组仔鼠前额皮质SERT的表达；B为对照组仔鼠前额皮质SERT的表达

图4 氟西汀组和对照组仔鼠P75前额皮质TPH表达变化（40×）A为氟西汀组仔鼠前额皮质TPH的表达；B为对照组仔鼠前额皮质TPH的表达

3 讨论

SSRI类抗抑郁药是一种新型抗抑郁药物，镇静作用小，不损伤精神运动功能，对心血管和自主神经系统功能影响很小。因此，已成为临床治疗抑郁症的一线用药。其中氟西汀的半衰期为2～3 d，是所有SSRI中最长的[8]，可以在母体血中聚集并排泄到乳汁。故本研究选用氟西汀作为代表药物，模拟临床发育期高血5-HT孤独症假说探究哺乳期服用SSRIs类抗抑郁药对子代行为学及SERT和TPH的影响。

以往的研究发现，母亲在围产期服用抗抑郁药，其子代在青少期可能会出现不同形式的行为异常，如孤独症样行为、社会交往障碍及运动功能亢进等[9]。本研究表明，哺乳期母鼠使用氟西汀对子代一般生长发育和行为学发育有较明显的影响，这些行为学的异常类似孤独症发育迟缓、社会交往障碍的表现[10]，本研究结果与之前的许多研究结果一致[10-11]。SIMPSON等[12]证实围产期妇女使用SSRI类抗抑郁药可导致子代出现新事物恐惧的概率增加，并且损害其青年期游戏行为；类似的，有学者证实围产期SSRI暴露可以改变子代成年期的社交行为[13-14]。RODRIGUEZ-PORCEL等[15]在P8～21给予哺乳期母鼠SSRI类抗抑郁药西酞普兰，结果表明在P39时西酞普兰组仔鼠新事物探索行为减少，P32时（青年期）雄性仔鼠游戏行为较对照组显著减少，P153时雄性仔鼠性行为明显减少。MACIAG等[16]采用上述同样的动物模型，证实新生儿期母鼠使用SSRI类抗抑郁药西酞普兰可导致子代大鼠成年后运动行为增加，性行为减少，快动眼睡眠时间增加，在强迫游泳实验中不动行为增加。

目前虽然孤独症的发病机制尚不清楚，但多数学者认为孤独症患者脑内均存在单胺类神经递质的异常[17-18]，其中5-HT神经递质异常最为常见。5-HT广泛存在于哺乳动物组织中，特别在大脑皮层及神经突触内含量很高，是一种能产生愉悦情绪的信使，在脑的形态发育，包括神经细胞的增值、分化和迁移中发挥着关键性作用[19-20]。5-HT受体则广泛存在人类大脑皮质、边缘系统和海马等区域，是参与多种认知、语言表达等功能的重要部位。5-HT系统被认为与注意缺陷、行为问题等发生存在关联。因此，5-HT系统的功能障碍与孤独症存在因果关系[21]。本研究也发现母鼠哺乳期服用抗抑郁药，子代大鼠儿童期（P35）和青年期（P75）前额皮质TPH及SERT较对照组明显减少。SIMPSON等[12]在啮齿类动物实验中也证实围产期抗抑郁药暴露可改变子代皮层5-HT环路功能，下调TPH及SERT表达。MACIAG等[16]也得到类似结论。TPH是5-HT合成的限速酶，5-HT由色氨酸羟化酶合成后少部分转运到细胞突触间隙发挥作用，大部分由突触前膜SERT转运至囊泡中储存。母鼠哺乳期服用氟西汀后，氟西汀及其活性代谢产物去甲氟西汀可分泌到乳汁，通过未发育成熟的血脑屏障到达发育期仔鼠脑中，特异性与SERT结合以抑制突触前膜SERT摄取5-HT至囊泡，从而提高突出间隙5-HT含量，使5-HT的合成（TPH）减少[12]。导致5-HT系统紊乱[22]。还有研究显示，约1/3孤独症儿童脑组织5-HT浓度增高[23]。

综上，哺乳期使用SSRI类抗抑郁药氟西汀对子代大鼠生长发育和行为学有较明显影响，这种影响可能与子代大鼠前额皮质SERT和TPH下调有关，但其具体机制目前尚不明确，有待进一步探索。然而，本研究未能检测外周血及中枢神经系统中5-HT水平，行为学检测手段亦有限。因此，在进一步机制研究中将比较中枢与外周血中5-HT水平，使用更丰富的行为学实验模拟发育期高血5-HT孤独症行为。

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The effects of offspring's behavior and SERT and TPH during the lactation exposure to fluoxetine.

CHEN Shu,CHEN Moxuan,JIANG Ling,LEI Lei,ZHOU Ya,CHEN Qian,AO Lijuan.The second Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650101,China.Tel:0871-5922957.

Objective To explore the influence of the lactation exposure to fluoxetine on offspring’s behavior and serotonin transporter(SERT)and tryptophan hydroxylase(TPH).Methods Six SD pregnant rats were randomly divided into 2 groups(n=3 each group).Experimental maternal rats were intraperitoneally injected with fluoxetine at a dose of 12 mg/kg from postnatal day 5 to 21.The control group were injected with the same amount of normal saline.In infancy,the offspring’s weight,hair length,eye opening and auditory development were measured.The free suspension test and bur⁃ied food pellets test were applied to evaluate the offspring’s behaviors.After postnatal day 21,all the offspring were wean.At early childhood(P35d)and adulthood(P75d),6 offspring rats from each group were executed to examine SERT and TPH in the prefrontal cortex by immunohistochemistry.Results The offspring’s weight of experimental group was significantly lower than control group(P＜0.05).The sensitivity of auditory in experimental group was significantly higher than control group(P＜0.01).The time of free suspension in experimental group significantly was decreased comparing to control group(P＜0.01).The SERT and TPH in prefrontal cortex was significantly lower in experimental group than those incontrol group either at childhood(P35d)or at adulthood(P75d)(P＜0.05).Conclusion Lactation exposure to fluoxetine re⁃sults in offspring’s abnormal development and behaviors through down-regulation of SERT and TPH in the prefrontal cor⁃tex.

Lactation fluoxetine behavioristics SERT TPH

R749.4；R749.94

A

2016-05-05）

（责任编辑:肖雅妮）

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.11.001

☆ 国家自然科学基金（编号：81260296）；昆明医科大学第二附属医院2015年研究生创新基金（编号：2015S90）

* 昆明医科大学研究生，现在华润武钢总医院康复科工作（武汉 430080）

△昆明医科大学第二附属医院康复科

※ 曲靖市中心医院康复科

◎ 昆明医科大学

（E-mail：13508710081@qq.com）