固液相色谱法同时检测畜禽粪便抗生素的方法

王忠琴（辉南县辉发城镇畜牧兽医站，吉林通化135100）

固液相色谱法同时检测畜禽粪便抗生素的方法

王忠琴
（辉南县辉发城镇畜牧兽医站，吉林通化135100）

目的：使用固相萃取——高效液相色谱法检测畜禽粪便中的抗生素残留。方法：使用Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液（pH=4.0）提取家禽粪便样品，经HLB固相萃取小柱纯化富集，以及高效液相色谱分离检测。结果：3信倍噪比下四环素、氟喹诺酮氨磺二甲嘧啶的检出限分别为0.20～7.20μg/kg、0.16～3.15μg/kg、0.05μg/kg，三种抗生素猪粪的加标回收率分别为60%～100%、41%～120%、94%～101%，鸡粪的加标回收率分别为70%～101%、65%～99%、115%～120%，相对标准差均在2.5%～9.3%之间。结论：固液相色谱法具较高的准确度，可对禽粪便四环素、喹诺酮及磺胺二甲嘧啶类抗生素同时检出。

家禽粪便；固相萃取；高效液相色谱

随着社会的不断发展，家禽养殖业也逐渐向现代化方向发展，规模化、集约化的养殖方式出现，使得抗生素家禽养殖中被广泛应用［1］。而抗生素在家禽体内的吸收性差，约有 30% ～90%的抗生素会以原药的形式随着粪便从家禽体内排除［2］，对土壤及地表水源造成污染。因此需要对家禽粪便中抗生素予以分析检测，以减少抗生素对环境的污染。笔者本次主要分析固液相色谱法同时对检测畜禽粪便抗生素的方法，内容如下：

1　仪器与试剂

1.1仪器与试剂

HLB固相萃取柱、Visiprep TM-DL固相萃取装置、WD-12氮吹仪、Agilent-1200高效液相色谱仪、ASE300加速溶剂萃取装置；土霉素、四环素、金霉素、诺氟沙星、环丙沙星、诺美沙星；甲醇、乙腈（色谱纯）柠檬酸、EDTA钠盐、NaOH等试剂为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2溶液配制

称取各类所需抗生素1毫克分别装入10毫升容量瓶中。使用甲醇溶解四环素类、磺胺类和大环内酯类抗生素。

1.3样品采集与处理

采集新鲜家禽粪便（选择本地区规模化家禽养殖场）样品冷冻干燥后，粉碎过筛，在家禽粪便样品中加入抗生素混合标准液，涡旋震荡 1分钟，常温下超声 20分钟，4℃下 10000转 /分钟离心 10分钟，取上清液 10毫升，重复上述步骤 2次，分别取上清液 10毫升、5毫升，将三次提取上清液混合后，取 5毫升予以超纯水稀释（甲醇含量＜10%），过固相萃取小柱，依次使用5毫升甲醇和5毫升 0.2mol柠檬酸溶液火化，将以上提取物以5毫升/分钟流速过柱，依次使用10毫升 5%甲醇溶液和10毫升水冲洗HLB小柱，用 10毫升二氯甲烷洗脱目标抗生素，洗脱液在氮气下吹干至 0.1毫升以下。加入 1μg内标物质 LOM，使用甲醇——水混合液定容至 1毫升，供HPLC-MS/NS检定。

1.4色谱条件

采用InertsilODS-3色谱柱；流动相为乙腈（A）和1%乙酸（B），流速为 0.8毫升 /分钟；柱温 30℃；梯度洗脱程序：0～18分钟，10%A；18～20分钟，37%，80%A。

2　结果

分别在各类样品中添加四环素类、喹诺酮类、硫胺二甲嘧啶类抗生素 1μg/g、5μg/g、10μg/g三个含量水平，结果显示猪粪的加标回收率分别为 60%～100%、41%～120%、94%～101%，鸡粪的加标回收率分别为 70%～101%、65%～99%、115%～120%。相对标准差均在2.5%～9.3%之间，说明检测方法的准确性和精密度高。

3　讨论

由于家禽粪便样品复杂，含有蛋白质、碳水化合物、脂肪和各种无机成分，因此在对样品进行选择时要确保标准物的定量。而在净化步骤中，对环境样品中抗生素前处理，HLB为目前效果最佳的柱子［3］。在洗脱实验中选择二氯甲烷作为洗脱机，主要是由于二氯甲烷对金霉素的洗脱率好，且洗脱下来的杂质少，使色谱图中的目标分离物和检测不受干扰。

抗生素是一种可离子化的极性有机化合物，因此流动相的pH值对抗生素物质的分离和检测非常重要，一般选择有机溶剂和缓冲液按照一定比例混合，最常见的有机溶剂为乙腈和甲醇，其对紫外线的吸收率低，缓冲液选择乙酸，主要是乙酸作为流动相的峰形好。过低的pH会降低色谱柱的使用范围，一般缓冲液的pH值控制在2～3内，流动相选择 1%乙酸（pH=2.6）。在检测时选择 270毫米作为检测波长，主要使用270毫米检测波长，对四环素、氟喹诺酮氨磺二甲嘧啶三种抗生素均具有较高的响应值，且分布相对均匀。

综上所述：固液相色谱法具较高的准确度，可对禽粪便四环素、喹诺酮及磺胺二甲嘧啶类抗生素同时检出。

［1］李艳霞，李帷，张雪莲，等.固相萃取4高效液相色谱法同时检测畜禽粪便中 14种兽药抗生素 ［J］.分析化学研究报告，2012，40（02）：213-217.

［2］王丽，钟冬莲，陈光才，等.固相萃取——高效液相色谱——串联质谱法测定畜禽粪便中的残留抗生素 ［J］.色谱，2013，31（10）：1010-1015.

［3］张敏，刘庆玉，敖永华.高效液相色谱——荧光检测畜禽粪污中四种氟喹诺酮类抗生素残留［J］.湖北农业科学，2012，51 （03）：602-604.

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ADOI编号：10.14025/j.cnki.jlny.2016.17.026

王忠琴，大专学历，辉南县辉发城镇畜牧兽医站，兽医师，研究方向：动物检疫。