文/王玉堂
用药指导渔用免疫增强剂的科研进展(一)
文/王玉堂
随着我国水产养殖规模的不断扩大,养殖品种的逐渐增多,高密度集约化养殖方式的演进,以及养殖环境的恶化等,水产养殖病害频繁发生,细菌性、病毒性和寄生虫性疾病流行,给养殖生产造成巨大损失,每年的直接经济损失都在100亿元以上,最高达150多亿元。
受水产养殖病害防治水平的限制,目前我国水产养殖病害防治仍以化学药物为主,尤其是长期以来使用抗菌、抑菌类及其它化学药物作为预防药物长期使用,不但会引起病原菌耐药性问题,也给养殖水产品的质量安全带来一定隐患,而且存在着对环境中微生态的破坏和威胁人类健康与生存等弊端。因此,应用免疫防治技术与方法,通过提高养殖水生动物机体免疫能力来达到有效预防疾病就显得格外重要,加强这方面的科研和技术应用推广也十分迫切。但是现有的疫苗虽然特异性强,但制备复杂,而且病体的经常变异、无国家的强制免疫扶持政策、免疫途径和免疫效果不足等问题,无法满足生产需要。
免疫增强剂又称免疫调节剂,是一类通过促进或诱导机体防御反应,提高机体自身非特异性免疫能力,增强机体对抗原微生物或病原体特异反应的物质。从广义上讲,免疫增强剂是指可以提高动物免疫能力的试剂,按其功能可以分为两大类:一类是增强动物的非特异性免疫功能;另一类是增强由免疫诱导的特异性免疫功能。对水产动物而言,多是关注在通过提高非特异性免疫机能来增强水产动物的抗病、防病能力的免疫增强剂。在贝类非特异性免疫系统中,免疫增强剂主要是通过激活吞噬细胞、激活本分氧化酶活力等来提高抗体的抗病能力;在鱼类免疫系统中,则主要表现为激活抗菌溶菌活力,提高抗体免疫效应以及激活补体等。目前已被证实有100多种物质具有免疫增强作用,研究和应用最多的是多糖和寡糖这两大业功能性糖类。它们又往往被称为免疫多糖和免疫寡糖。多糖和寡糖在人类保健和畜牧业已得到广泛研究和应用,但在水产养殖方面开展的应用研究还不多,不够深入。由于免疫增强剂具有无药残、不会产生耐药性,安全、无毒、高效、低成本、不污染环境等诸多优点而越来越受到业界重视,利用功能性糖类提高鱼、虾等水产养殖动物的非特异性免疫抗病能力已成为国内外水产养殖病害防治领域的研究重点。因此,免疫增强剂对水产健康养殖业的发展具有重要意义。目前,用于鱼类免疫增强作用的物质主要有以下几类:微生物多糖、甲壳素和壳聚糖、植物多糖、动物提取物、化学合成物、营养元素、激素及其它细胞因子等。
影响鱼类免疫功能的因素有许多,既有内因,如病原入侵、种质退化、年龄及代谢机能下降等;也有外因,如各种环境因素,如温度、营养、密度、水体污染等。了解鱼类的免疫功能下降的原因,采取相应对策,可以提高鱼类的免疫功能,进而提高鱼类的健康水平。其几种环境因素对鱼类免疫功能影响的研究进展如下。
(一)温度
鱼类是变温动物,温度对鱼类的免疫应答铁影响很大。各种鱼类都有不同的免疫临界温度,当环境温度高于免疫临界温度锂,鱼类产生免疫应答;相反,当环境温度低于免疫临界温度时,鱼类则不能产生免疫应答,或免疫应答极弱。一般而言,温水性鱼类的免疫应答临界温度较高,冷水性鱼类的免疫临界温度较低。免疫临界温度还取决于鱼类原来所处的水域(温带或或寒带)以及原来是否接触过同类抗原等。
鱼类在适宜生长的温度条件下,温度越高,免疫应答越快,抗体滴度越高,达到顶峰值的时间越短。试验表明,各种鱼类的抗体生成速度并不一致。同样在最适温度条件下,大麻哈鱼经免疫后4周~8周,凝集抗体效价达到最高,而虹鳟鱼则需6周~7周、鲤鱼仅需3周~4周即可达到高峰值。
当温度下降至免疫应答临界温度以下时,低温限制浆细胞释放抗体,这时体液免疫便宜失去了防御作用。但只要鱼类初次接触抗原时有一短暂的时间处在免疫临界温度之上,则抗体的形成便不再受温度影响。如鲤鱼在25℃水温条件下,9天内即可对抗原的刺激产生反应而产生特异性抗体;而在12℃条件下,受免疫的鱼则不会产生抗体;但是,如果将受免疫的鱼在25℃条件下饲养4天后,再移到12℃条件下继续饲养,则正常的免疫应答继续进行。
(二)水体污染
水体有机物如各种农用杀虫剂(有机氯和有机磷)、石油烃、有机锡等,这些物质对鱼类特异性和非特异性免疫均有显著毒性影响。研究发现,水体有机磷污染物,如草甘磷等,会使罗非鱼脾细胞、T细胞、B细胞的增殖分裂随污染物浓度升高而明显下降,免疫活性受到严重损害。Goncharov等试验证明,水体中低浓度的酚对鲤鱼的抗体生成有影响。他们用点状气单胞菌制成的疫苗注射鲤鱼后,饲养在本分浓度12.5mg/L的水体中2个月,抗体检测结果表明,比饲养在未污染水体中的对照鱼要弱得多,而且随着抗体产生量降低,血清中总蛋白量也降低。
工业污水(如造纸厂废水等)和废弃的漂白液(主要含氯和氯化物)污染的水体,可使拟鲤机体中的血清免疫球蛋白水平明显下降。Mcleay等研究证实,造纸废水对饲养的银大座哈鱼的免疫应答有影响,能抑制抗体的生成。
水体中的重金属离子Zn2+、Cu2+、Mn2+、Mg2+、Hg+、Cd+、Pb2+等达到一定浓度时会对鱼类造成毒害,干扰或阻止鱼类对抗原的应答。Cu2+可使虹鳟脾脏抗体分泌细胞的活性受到抑制。鳙鲽在镉污染的水体中对抗原的刺激不发生应答。Soivio等报道,将注射过灭活变形杆菌疫苗的虹鳟放入浓度为0.3ng/L的Zn2+污染的水体中饲养,结果受免疫鱼类不产生抗体,而对照鱼则有抗体产生。
(三)营养
当环境条件一定时,饲料中的营养成分及含量对鱼类抗体的形成影响很大。如对相同免疫刺激,营养条件差的鱼所产生的凝集抗体效价要低得多,这是因为鱼的饲料不足或低蛋白饲料导致鱼体血清蛋白含量下降,缺乏形成抗体蛋白质的缘故。研究证实,鱼类饵料中存在大量的维生素C时,能促进其抗体的生成。饵料缺乏维生素B12、维生素C和叶酸时,会引进鱼类分号血,并影响抗体生成。而在饲料中适量添加剂一些含硫氨基酸(如胱氨酸、半胱氨酸),可以提高鱼类免疫效果。
(四)季节与光照周期
季节对鱼类体液免疫应答也有影响。研究发现,在同一温度条件下,2月份免疫的鱼所产生的抗体效价高于11月份同类鱼的抗体效价,这可能与光照周期有关。在生殖季节,鱼体血清中蛋白变化很大,尤其是雌鱼,说明其对免疫球蛋白的合成也会有一定影响。
光线照射强度对细胞免疫也有影响,实验发现,用光线照射,可以延长鱼体组织移植物的存活时间。对于虹鳟而言,光照时间的延长可减少其体内流动白细胞的数量;相反,通过减少暴露在光照下的时间,也可增加白细胞的数量。光周期的延长也可增强溶菌酶活性,以及增加流动免疫球蛋白M的含量。
(五)放养密度
养殖密度过高而造成的拥护胁迫可能导致鱼类直接死亡,而亚致死强度的拥护胁迫可使鱼类产生应激反应。应激中是一种保护性反应,但可引起血浆皮质醇增高,由于皮质醇类有免疫抑制作用,因此,使鱼类持续性地处于应激状态,机体的特异性和非特异性免疫防御系统的功能会受到抑制,导致体重下降、生长缓慢、对疾病的敏感性增强等。外源皮质醇注入鱼体后,也可改变鱼类免疫器官的形态,抑制免疫功能,减少对疾病的抵抗力。研究表明,如果放养密度过大,鱼处于的环境中,产生抗体的效价就会降低。这是由于处于过分拥护的环境中,鱼体内的血清中产生一种免疫抑制剂(脂蛋白)所致。
(六)水质
鱼类免疫应答也受环境中溶氧含量的控制,缺氧可减轻巨噬细胞的呼吸爆发活性及流动抗体的数量;相反,溶氧充足时,也可以得到提升。长期处于低溶氧状态下的鱼体,由于体质减弱,生成抗体的能力较差。
水体的盐度也是影响鱼类免疫功能的一个重要因素,向淡水鱼类养殖水体中增加盐度,会导致体内分解酶活性的增强,巨噬细胞的呼吸爆发量及流动性免疫球蛋白M含量的增加。但是,盐度能引起这些变化的原因目前还不清楚。一些学者提出增加水体的盐度可赶到抑制环境中的病原体生长的作用。
白细胞的吞噬功能是通过吞噬作用破坏异物,它的溶酶体中含有溶菌酶、蛋白水解酶、曲过氧化酶等。pH值对这些年来细胞酶的影响,导致了白细胞溶酶体内的各种酶体的活性出现峰值的范围处于pH值7.5时。由于吞噬指数所得到的曲线来看,pH值7.5时胞内消化功能最强,对吞噬体的消化和降解作用也最激烈。实验证实,偏碱性的水体对草鱼免疫反应较为适宜,能够较大强度地发挥其免疫系统功能,抵御外来抗原的侵袭,减少疾病的生发;而偏酸性的环境中,由于免疫系统反应程度受到抑制,使鱼体抵抗力降低,大而增加了发病几率。因此,在草鱼养殖生产过程中,应尽量使环境处于稍偏碱性的状态,即pH值7.5左右。
(一)微生物多糖
酵母菌聚糖能选择性地作用于巨噬细胞、颗粒细胞等细胞的特异性受体,并激活这些细胞,通过细胞的吞噬作用,吸收、破坏、清除动物体内的病原微生物,同时还能产生细胞因子,如白细胞介素1(L-1),提高鱼类的免疫能力。
细菌细胞壁中的肽聚糖也是鱼类很好的免疫增强物质。在饲料中添加肽聚糖能提高大黄鱼的生长性能、非特异性免疫能力和抗病力,可作为一种安全高效的口服免疫增强剂应用于大黄鱼的养殖。须知聚糖与疫苗联合使用,可以显著提高鲫鱼体表粘液和血清溶菌酶活性、白细胞的吞噬活性、抗体效价及活菌攻毒后的免疫保护率,是疫苗的良好佐剂,能增强鱼类的疫苗的应答反应。脂多糖存在于所有革兰氏阴性菌外膜中,当脂多糖免疫鱼后,一方面是鱼体可以产生对该种病原微生物的特异性免疫保护;另一方面是可以增强鱼体单核吞噬细胞系统的活性及其它抗菌因子的活性。如柱状嗜纤维菌的脂多糖免疫注射鲤鱼后,鲤鱼血清中的凝集抗体效价迅速上升,并使其血清白细胞吞噬指数和吞噬百分比显著提高。
(二)甲壳素和壳聚糖
甲壳素又称几丁质,广泛存在于昆虫、甲壳动物等的外壳及真菌的细胞壁中。甲素脱去乙酰基成为壳聚糖,又称壳多糖。壳聚糖可生物降解,其代谢产物无毒,具有抗微生物活性、激活淋巴细胞、提高免疫力、调节脂肪代谢和降低血脂、胆固醇等多种生理功能。在饲料中添加壳聚糖可以提高花鲈、异育银鲫、真鲷、野鲮和吞噬细胞活性,增强其非特异性免疫功能。研究结果证实,在饲料中添加适量的壳聚糖,能使鲫鱼各种组织溶菌酶活性和白细胞吞噬活性增高,表明壳聚糖能激活水解酶的活性,增强机体抗感染能力。美洲红点鲑和虹鳟经壳聚糖溶液注射或浸泡后,血液中的一些免疫指标,如杀菌活力、过氧化酶活性和IgM浓度均显著提高,对杀鲑气单胞菌感染的抵抗力也显著增强。口服甲壳素可以显著提高金头鲷的巨噬细胞活性、细胞毒活性和血清补体活性等。
(三)植物多糖
用于鱼类的植物性免疫多糖主要有黄芪多糖、云芝多糖、牛蒡寡糖、枸杞多糖等。黄芪多糖具有提高动物机体免疫力、阻止病毒复制、杀灭细菌、排出毒素等功效,并具有用量少、作用快、果好等特点。在饲料中添加黄芪多糖可使鲤鱼白细胞的吞噬率显著提高,还可显著提高吞噬指数,对白细胞活性的促进作用较为明显。云芝多糖添加0.5g/kg~1.0g/kg时,对银鲫的非特异免疫功能有增强作用,其投喂周期为14天~21天。牛蒡寡糖是有效的双歧杆菌促生长因子,能显著促进机体胃肠道内有益菌群的生长和增殖,对大菱鲆表现出良好的促生长作用,还能够显著提高饲料利用率;其饲料中的添加量为4.0g/kg。鲫鱼饲料中添加45mg/kg枸杞多糖能够显著提高鱼体血清溶菌酶活力,增强免疫力。
冬宝是用黄芪、干姜、陈皮等组成的中草药复合制剂。据乔峰(2000)试验表明,在鲤鱼饲料中添加0.1%的冬宝,在越冬期间,鲤鱼成活率比对照组提高敢43.7%,增重率提高8.3%。说明冬宝是养殖水生动物抗寒冷应激良好的饲料添加剂。(未完待续)
作者单位:全国水产技术推广总站