基于可变数目串联重复序列的结核病分子流行病学研究

基于可变数目串联重复序列的结核病分子流行病学研究

孙雪娟 赵振国 邓 平 张 宇 陈中秀 韩晓蓉 谢清波 王 珏

为了解吉林省结核杆菌的基因型多态性，以及各菌株之间的进化关系，本研究提取80例临床患者的结核杆菌基因组对数目可变串联重复序列（VNTR）基因分型进行分析研究。结果显示重复单位（MIRU）及MIRU+乙烯受体蛋白基因（ETR）的成簇菌株比ETR的要少。研究证明，VNTR位点适用于结核杆菌基因分型，VNTR分型可以做为吉林省结核病分子流行病学研究有效方法。

结核杆菌；可变串联重复序列；基因分型；流行病学

结核病属于感染性疾病类型，主要有结核分枝杆菌感染引发，可在感染后长期潜伏于机体中。传统的流行病学方法在预测结核感染状况中有一定的应用价值，但是也受到明显限制。近年来生物和计算机技术的发展为结核感染的诊断、爆发趋势的预测等均提供了全新的契机，优势明显［1］。基于此，本研究特选取80例确诊为结核病的患者实施临床试验，并对其基因组结构状况进行分析，以期为结核分枝杆菌感染的诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

选取吉林省大型综合医院门诊2014年1月～2016年11月收治的80例确诊为结核病患者的临床痰标本作为受试对象，取其痰液标本。

1.2 结核分枝杆菌培养方法

取合格的痰液标本制备成痰涂片，经过抗酸染色后实施镜检。将处理后的标本混合均匀后在7H9液体培养基中进行培养，充分混合均匀后取其中的200μl混合液加入微孔板中，添加50μl石蜡液体在37℃条件下培养，按照颜色变化观察结核分枝杆菌感染情况。

采用改良罗氏培养法将痰标本接种于培养基中，在37℃恒温条件下培养分型，将所得结核分枝杆菌菌株作为试验株备用。

1.3 聚合酶链反应（PCR）试验方法

1.3.1 提取结核分枝杆菌的DNA 参照相关文献提取结核分枝杆菌的DNA［2］，首先需要加入500μl降解溶液，并加入3μl蛋白酶K，混合均匀后预热，采用ENA提取试剂盒并严格按照使用说明书步骤完成操作。

1.3.2 PCR扩增反应 将上述操作所得样品分别对结核分枝杆菌VNTR位点下ETR、MIRU及ETR+MIRU进行PCR扩增反应，扩增条件均为：预变性95℃ 5 min，变性94℃ 30 s，退火45 s（温度分别为60℃、58℃和65℃），延伸72℃ 30 s，共进行30个循环操作，最终72℃条件下延伸10 min。

1.3.3 PCR反应产物鉴定 采用琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件为：1.5%浓度琼脂糖凝胶，100 V电压，90 min，根据凝胶成像系统对电泳条带进行观察，并计算产物片段的长度。

1.4 VNTR位点多样性分析及相关组合对菌株分辨能力评价

1.4.1 等位基因多样性评价 等位基因多样性分析公式：

其中n、χi值分别指实验菌株总数和在某个位点等位基因的频率。

1.4.2 位点组合评价 参照公式［2］：

其中S、N和nj分别指实验菌株不同基因型数目、实验菌株总数及第j个基因型的菌株数量。

2 实验结果

2.1 PCR结果

本研究中80株结核分枝杆菌PCR结果显示有44株属于北京家族，其中42434和424353分别有27株和17株。

2.2 基因分型结果

实验结果发现ETR、MIRU、MIRU+ETR分别有34株、22株、24株。

3 讨论

随着计算机技术的发展，人们对分子流行病学的认识和研究不断深入，借助现代化检验手段能够对致病菌的基因型进行检测并借此评估不同基因型之间是否具有亲缘性［3-4］。在生物医学领域中，常将相同的基因形成的集合称为“簇”，若成簇的菌株比较多，那么便可以据此确定其属于相同的基因型，并且推测病原菌菌株具有明显的爆发趋势［5］。由此可知，通过利用现代计算机和生物医学技术能够对结核分枝杆菌感染的基因型进行检测，分析某地区该致病菌感染是否具有爆发趋势［6］。

MIRU技术是以PCR技术为基础的基因分型技术，在结核分枝杆菌基因分型检测中占据重要的地位，较传统的IS6110-RFLP技术操作更为简单且结果相对精确，显示出良好的应用前景。本研究结果显示ETR 5个位点有6个基因型，而MIRU12和MIRU+ETR15个位点均有8个基因型，说明本研究中基因成簇数较少，并且相对来说比较集中。此外ETR成簇菌株明显多于其他两个位点，说明分型效果及分辨率明显不如MIRU及MIRU+ETR。根据检测结果和笔者既往工作经验分析其中原因为：（1）所选样本量较少，得出的结果并不具有代表性，仍需要选取大样本数据进行试验研究；（2）所有病例均来自吉林省地区，不具有代表性；（3）所用的方法以及检测设备条件受到一定限制，且均受到基因分型方法分辨率的影响［7-8］。

与传统的流行病学相比较，分子流行病学不仅能够对传染源进行追踪，同时还可以对其基因分型特点和检测结果进行分析，通过绘制系统性的进化树对优势感染菌株进行详细了解后明确致病菌感染的爆发趋势。此外，在分子流行病学研究中还可以通过对成簇的基因型感染患者的社会网络关系进行调查，从而确定结核病最为原始的感染源，以便及时控制感染结核分枝杆菌感染情况，降低结核病的发生率。

综上所述，吉林省结核病分子流行病学的监测需要引起高度的重视，以便及时进行预防和干预，此外采用新型的基因型检测技术能够对其分子流行病学爆发趋势进行动态监测，对结核病早期感染也可快速做出诊断。

［1］ 董毅，吴利先． 结核分枝杆菌基因分型技术的研究进展［J］． 国际流行病学传染病学杂志，2013，40（5）：336-339．

［2］ 王春雨． 基因分型技术在梅花鹿结核病研究中的应用［D］． 长春：吉林农业大学，2008：24．

［3］ 王春雨． 结核杆菌Taqman PCR检测方法建立及吉林省鹿结核杆菌MLVA分型研究［D］． 长春：吉林农业大学，2011：31．

［4］ 谭云洪，赵秀芹，刘志广，等． 湖南省231株结核分枝杆菌Spoligotyping和MLVA基因分型方法及其结果分析［J］． 中华预防医学杂志，2010，44（10）：947-948．

［5］ 陈靖． 结核分枝杆菌北京基因型菌株的鉴定及分型方法的建立及应用［D］．上海：复旦大学，2009：39．

［6］ 张辉． 固定剂量复合剂应用于结核病防治的分析［J］． 中国继续医学教育，2015，7（11）：236-237．

［7］ 吴建勇，吴星星，杨学云，等． 绵羊副结核病的病原学检测与分析［J］． 新疆农业科学，2016，53（8）：1562-1568．

［8］ 马慧，胡屹，蒋伟利，等． 中国东部农村地区结核分枝杆菌北京基因型菌株的成簇性及耐药特征研究［J］． 中华结核和呼吸杂志，2011，34（6）：447-450．

The Molecular Epidemiology of Tuberculosis Based on Variable Number Tandem Repeat Typing

SUN Xuejuan ZHAO Zhenguo DENG Ping ZHANG Yu CHEN Zhongxiu HAN Xiaorong XIE Qingbo WANG Jue Department of Clinical Laboratory，Changchun Infectious Disease Hospital，Changchun Jilin 130123，China

In order to understand the gene polymorphism of Jilin province Mycobacterium tuberculosis strains，and the evolutionary relationship，this study extracted 80 clinical patients with Mycobacterium tuberculosis genome for variable number of tandem repeats（VNTR）genotyping were analyzed． The results showed that strain mycobacterial interspersed repetitive units（MIRU）and MIRU clusters environmental tax reform（ETR）have less than ETR． Research showed that VNTR is suitable for genotyping of Mycobacterium tuberculosis，and VNTR typing can be used as an effective method to study the molecular epidemiology of tuberculosis in Jilin province．

Mycobacterium tuberculosis，VNTR，Genotyping，Epidemiology

R181．3

A

1674-9316（2016）36-0005-02

10．3969/j．issn．1674-9316．2016．36．003

吉林省卫生厅科研课题（2013Z038）

长春市传染病医院检验科，吉林 长春 130123