禽呼肠孤病毒分子生物学诊断技术及基因工程疫苗的研究进展*

李天芝，于新友，王金良，沈志强

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

禽呼肠孤病毒分子生物学诊断技术及基因工程疫苗的研究进展*

李天芝1，于新友1，王金良2，沈志强2

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

本文综述了禽呼肠孤病毒分子生物学诊断方法，主要包括核酸探针、RT-PCR方法、套式RT-PCR方法、多重RT-PCR方法、荧光定量RT-PCR方法、环介导等温扩增方法等6种方法，并就其基因工程疫苗方面的研究进行了着重阐述，对禽呼肠孤病毒病的诊断和防控有一定的参考价值。

禽呼肠孤病毒；分子生物学诊断；基因工程疫苗

禽呼肠孤病是由呼肠孤病毒引起的一类禽类传染病，其临床表现因毒株和感染宿主的不同而不同[1]。鸡感染禽呼肠孤病毒临床表现为关节炎、腱鞘炎、呼吸道病、肠道病、矮小综合征和吸收障碍综合征等[2]。引起鸭发病的呼肠孤病毒有新型鸭呼肠孤病毒(Noval duck reovirus，NDRV)和番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus，MDRV)，鸭感染后主要临床表现为软脚、腹泻等，有的能够引起高达98%的死亡率，病理变化则主要以肝、脾灰白色局灶性坏死为特征[3]。引起鹅发病的呼肠孤病毒为鹅呼肠孤病毒(Goose reovirus，GRV)，雏鹅感染后也可表现为关节炎，病理变化主要是肝、脾坏死和心内膜部分出血等，该病给世界养禽业造成严重的经济损失[4]。1954年，Fahey和Craloley首次从慢性呼吸道疾病的鸡呼吸道内分离到禽呼肠孤病毒[5]，此后，英国、美国、意大利等相继报道了禽呼肠孤病毒感染引起的疾病，20世纪80年代我国出现禽呼肠孤病毒引起的疾病相关报道。本文就近年来禽呼肠孤病毒的分子生物学诊断方法及基因工程疫苗研究进展进行综述，以期为禽呼肠孤病的快速诊断和防控提供参考。

1 分子生物学诊断

1.1 核酸探针 核酸探针是定性或定量检测特异RNA或DNA序列的技术，它具有操作简单、结果易于判定等优点，适合在基层推广使用。Liu等[6]通过地高辛标记建立的cDNA探针技术，最低可检测0.78ng的禽呼肠孤病毒RNA，该法不仅能定位感染组织中的禽呼肠孤病毒，还能在临床症状出现前检测到禽呼肠孤病毒，具有较高的灵敏性。谢芝勋等[7]用地高辛标记的禽呼肠孤病毒S1 cDNA制备探针，建立了检测禽呼肠孤病毒的方法，结果显示，该探针能与禽呼肠孤病毒不同毒株核酸抽提物起特异性杂交反应，而与对鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、新城疫病毒、大肠杆菌、正常鸡胚尿囊液抽提的核酸及载体PBluescript空质粒DNA的杂交反应均为阴性，该探针对禽呼肠孤病毒RNA的最低检出量为0.45ng。

1.2 RT-PCR方法 RT-PCR是以病毒的RNA为模板进行反转录，再以PCR进行核酸扩增来检测病毒的方法，以其简便、迅速、灵敏等优点在动物疾病诊断上得到了广泛的应用。Lee等[8]根据禽呼肠孤病毒S3基因，设计引物，建立了检测禽呼肠孤病毒的RT-PCR方法，该法可扩增大小为672bp目的片段，最低能检测到0.2pg禽呼肠孤病毒RNA模板，通过印迹转移后杂交还可将灵敏度提高到0.04pg。孔丰等[9]参考GenBank上登录的NDRV S3基因保守序列设计特异性引物，建立了检测NDRV的RT-PCR方法，结果显示，该方法仅能从NDRV分离毒中扩增到与预期大小相符、长度为298bp的特异性目的片段，检测灵敏度达到83.4pg病毒RNA，而对番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭新城疫病毒和禽流感病毒等样品的扩增结果均为阴性。叶伟成等[10]根据经典和新型水禽呼肠孤病毒σA基因的保守序列设计一对PCR引物，建立了番鸭呼肠孤病毒通用RT-PCR检测方法，可扩增出大小为436bp目的条带，其最低病毒检出量为3.6TCID50，对鸭甲肝病毒、鸭瘟病毒、新城疫病毒、坦布苏病毒、番鸭细小病毒、产蛋下降综合征病毒和H9N2亚型禽流感病毒扩增结果均为阴性。于新友等[11]根据禽呼肠病毒P10基因保守序列设计了一对引物，建立了检测禽呼肠病毒的一步法RTPCR方法，并对其特异性、敏感性进行了研究，该一步法RT-PCR对禽呼肠病毒扩增结果为阳性，对照毒株扩增结果均为阴性，对禽呼肠病毒检测的灵敏性为10pg总RNA。

1.3 套式RT-PCR方法 套式RT-PCR是使用两对PCR引物扩增完整的片段，以第一对引物的扩增产物为模板进行第二轮扩增反应，检测的特异性更好，敏感性也更高。Liu等[12]发明了一种用套式RT-PCR扩增σC编码基因，然后进行限制性内切酶分析的诊断禽呼肠孤病毒感染的方法，普通RT-PCR可检测到100-10-1TCID50的病毒核酸，而用Southern杂交法可检测到 10-1-10-2TCID50的病毒核酸，当使用套式PCR引物时，敏感性可增加大约103～104倍。毕研丽等[13]根据GenBank中登录的ARV基因组序列，设计合成了2对引物，建立了适合禽呼肠孤病毒快速检测的套式RT-PCR方法，外部引物的扩增片段大小为478bp，内部引物的扩增片段大小为247bp。采用该方法对禽呼肠孤病毒株进行了检测，均能扩增到247bp的条带，而禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性腔上囊病病毒、减蛋综合征病毒、禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生病病毒、马立克病病毒和鸭瘟病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100pg，第2次扩增的敏感性是1fg，第2次比第1次扩增的敏感性高105倍。

1.4 多重RT-PCR方法 多重RT-PCR是在常规RT-PCR基础上发展起来的，在同一PCR体系中，加入多对引物，同时检测2种或多种病原核酸，它具有快速、灵敏度高、特异性强等优点，广泛用于各种临床疾病的快速诊断。张琳等[14]禽呼肠孤病毒、禽流感病毒、新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的基因保守区设计了4对特异性引物，建立了针对四种病毒的多重PCR检测体系，该体系扩增的禽呼肠孤病毒、禽流感病毒、新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒四种病毒基因片断大小分别为199、264、362和459bp，且特异性、敏感性良好，最低可分别检测1pg、10pg、10pg和10pg的RNA量。孙晓军等[15]据鸭甲肝病毒的3D基因序列和NDRV的S3基因序列，分别设计了1对特异性引物，通过条件优化建立了鉴别鸭甲肝病毒和NDRV的复合RT-PCR方法。该方法对鸭甲肝病毒和NDRV的最低检出量均为100copies，而对番鸭呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、鸭坦布苏病毒和鸭副粘病毒的检测结果均为阴性。

1.5 荧光定量RT-PCR方法 实时荧光定量PCR是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术，它融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点。韩宏宇等[16]建立了NDRV基于SYBR GreenⅠ的实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法最低可检出15个拷贝的病毒cDNA，其病毒最低检出量为0.5TCID50。该方法具有良好的特异性，对鸭坦布苏病毒、A型鸭甲肝病毒、C型鸭甲肝病毒、番鸭呼肠孤病毒、减蛋综合征病毒、鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒、鸭疫里默氏杆菌的检测结果均为阴性。该方法重复性好，组内变异系数为0.32%～0.91%，组间变异系数为1.03%～1.51%。李天芝等[17]利用RTPCR技术扩增出禽呼肠孤病毒 S1基因中 298bp的保守序列，并克隆到pMD18-T载体中作为标准品制作标准曲线，建立了ARV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达4.8×101拷贝，与NDV、AIV、IBV、IBDV、ALV、REV均不发生交叉反应，具有良好的特异性和重复性。

1.6 环介导等温扩增技术 环介导等温扩增(LAMP)方法是日本学者Notomi等发明的一项恒温核酸扩增技术，具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济等特点，特别适合在现场和基层部门应用。马利等[18]建立了一种基于荧光显色的禽呼肠孤病毒LAMP检测方法。该检测方法使用针对禽呼肠孤病毒的p10基因8个区域的6条LAMP引物，能够在63℃恒温条件下1h内完成反应，具有良好的敏感性和特异性，最低能够检出102个拷贝的病毒，敏感性比普通PCR高100倍，而对其他病毒检测结果为阴性。在荧光显色中分别应用SYBR GreenⅠ和钙黄绿素作为显色剂，其结果与琼脂糖凝胶电泳一致。于可响等[19]建立适于基层实验室快速检测NDRV的一步RT-LAMP方法。基于新型鸭呼肠孤病毒S3基因的6个保守区域设计了4条LAMP引物，利用Bst DNA聚合酶在63℃恒温保持45min即可完成反转录和扩增反应，由此建立了RT-LAMP检测方法。该方法具有良好的特异性，除NDRV外对其他6种常见鸭病的检测结果均为阴性。该方法对病毒RNA的最低检出量为 0.1pg，是常规 RT-PCR方法的 100倍。临床应用结果表明，该方法与病毒分离鉴定方法的符合率为98%。

2 基因工程疫苗

2.1 亚单位疫苗 只含有病原微生物的抗菌抗原成分，而不含有核酸，但能刺激机体产生特应性免疫应答的一类疫苗，称为亚单位疫苗。凌珊珊等[20]构建了禽呼肠孤病毒σC基因的原核表达载体pET32a-σC，成功表达了重组蛋白σC，纯化后，进行动物试验，并用S1133毒株进行攻毒，结果显示，σC蛋白刺激机体产生保护性的中和抗体同商品化S1133全病毒灭活苗的效果大致相当。Kuntz-Simon等[21]将杆状病毒中表达的σC蛋白，隔3周免疫2次，攻毒后发现可以部分甚至完全防止临床症状的出现，而且免疫后可以减少呼肠孤病毒导致的腱炎和心包炎的产生。徐延伟等[22]根据已公布的禽呼肠孤病毒S1133毒株σC基因克隆至pPIC9K酵母表达载体当中，成功构建了重组酵母菌株pPIC9K-σC/GS115。将毕赤酵母表达的重组σC蛋白用法国佐剂乳化后，免疫3周龄SPF鸡，并进行攻毒实验，结果显示，该重组σC蛋白可以阻止ARV在体内的复制，且能够对感染病毒进行清除。吴晓平等[23]将番鸭呼肠孤病毒σC与σB基因的重组大肠杆菌 pET-30a-S3/BL21和 pET-30a-S4ORF2/BL21，分别成功表达出重组蛋白σC与σB，将DRVσB蛋白、DRVσC蛋白、DRVσB+σC蛋白分别免疫雏番鸭，并设PBS对照组和攻毒对照组，攻毒保护试验结果显示使用原核表达的番鸭呼肠孤病毒外壳蛋白σC与σB制备油乳剂，联合免疫可诱导雏番鸭快速产生一定效价的抗体，并提供良好的免疫保护力。

2.2 核酸疫苗 构建含有外源抗原基因的重组质粒，免疫动物后，表达的特异性抗原蛋白通过与MHC-Ⅰ类或MHC-Ⅱ类抗原分子结合，刺激机体产生特异性免疫应答，该类疫苗称为核酸疫苗，又名DNA疫苗。谢志勤等[24]构建含禽呼肠孤病毒S1133毒株的σ3基因重组质粒pcDNA3.1-σ3，免疫7日龄SPF雏鸡，同时设灭活S1133、表达σ3蛋白及生理盐水对照，二次加强免疫两周后，用S1133毒株进行攻毒，结果表明，pcDNA3.1-σ3处理、灭活S1133处理、表达σ3蛋白处理和生理盐水处理的病毒检出率分别为7.4%、3.7%、11.1%和29.6%，pcDNA-σ3处理与生理盐水处理的差异显著(P＜0.05)，但与灭活S1133处理、表达σ3蛋白处理的差异不显著(P＞0.05)。蒋慷慨等[25]成功构建了真核表达质粒 pCIS3和 pCIS4ORF2，分别以pCIS3、pCIS4ORF2、pCIS3+pCIS4ORF2，100μg的免疫剂量分别肌肉注射免疫2日龄番鸭，对照番鸭则以PBS肌肉注射免疫。首次免疫1周后以相同剂量和途径加强免疫，加强免疫后1周后用TCID50为10-7.1934/0.1ml病毒液肌肉注射攻毒，攻毒量为：0.2ml/只，结果显示，所有免疫组在加强免疫后攻毒前抗体均转阳，攻毒后pCIS3+pCIS4ORF2联合免疫组可对免疫番鸭形成100%完全保护，pCIS3免疫组可对免疫番鸭形成 80%保护，pCIS4ORF2免疫组对免疫番鸭形成90%保护。

2.3 活载体疫苗 采用弱毒或无毒病原微生物作为表达载体，对其导入外源抗原基因，制成疫苗后，接种动物，诱导机休产生特异性免疫应答反应，这类新型疫苗称为活载体疫苗。万俊杰等[26]构建了能表达禽呼肠孤病毒σB、σC基因的重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAX-σB)、SL7207(pVAX-σC)、SL7207(pVAXAB-σB-σC)，并分别以 1.0× 109CFU的剂量每隔2周免疫雏鸡3次，设空质粒和PBS组作，结果显示，首免后2周SL7207 (pVAX-σC)与空质粒SL7207(pVAX1)以及PBS对照组相比产生了较高的血清抗体IgG(P＜0.05)，而SL7207(pVAXAB-σB-σC)与空质粒以及PBS对照组相比产生了较高水平的粘膜抗体IgA(P＜0.01)，各疫苗免疫组在二免后第二周均能产生较高的血清抗体IgG和粘膜抗体IgA，SL7207(pVAX-σC)与其它免疫组相比差异显著(P＜0.01)，到三免后第二周各组抗体水平进一步升高，其中SL7207(pVAX-σC)与SL7207(pVAXAB-σB-σC)组较其它组产生了较高的血清抗体和粘膜抗体水平(P＜0.01)。王存伟等学者[27]成功构建了介导禽呼肠孤病毒。σC基因疫苗的重组减毒沙门氏菌株，制备出禽呼肠孤病毒。σC基因疫苗，应用于雏鸡，以1.0×l09CFU剂量1次免疫6口龄雏鸡，并于2周后进行二免，结果显示，免疫2周后，可诱导机体产生ARVσC蛋白的特异血清IgG抗体，差异显著(P＜0.01)，二免后3周进行攻毒试验，保护率可达66.7%，重组减毒沙门氏菌株对雏鸡具有良好的免疫原性和安全性。

3 小结与展望

想成功的控制和清除禽呼肠孤病毒的感染，需要采用常规监测和疾病诊断相结合的方法，虽然禽呼肠孤病毒分子生物学鉴别诊断方法有很多，但各有利弊，常规RT-PCR方法虽然检测速度快、特异性强，但不能准确的定量，且敏感性有限。荧光定量 RT-PCR方法虽然克服了常规RT-PCR的缺陷，但仪器和探针的合成价格昂贵，检测成本比较高，不适合大面积推广应用。LAMP方法虽然简单、方便，适合基层进行推广应用，但灵敏度太高，易出现假阳性结果。因此，对于所有的情况和动物，目前仍没有一种监测技术是100%可靠的，近年来，各国专家、学者对禽呼肠孤病毒基因工程疫苗进行了一定的探索和研究，并取得了一定的成绩，但各种新型疫苗都有其自身的缺陷和不足，如亚单位疫苗当前没有获得自然形态的蛋白，抗原获得困难。核酸疫苗可能存在基因突变或整合到宿主基因组的危险。活载体疫苗可以引起炎症反应。相信随着生物技术的不断发展和新技术的引入，一些检测速度快、结果准确、价廉的检测方法将会被建立，安全、高效、易于保存和运输的新型基因工程疫苗必将研制成功，从而最大程度的预防或控制禽呼肠孤病毒病的爆发流行。

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Q789

：A

：1673-1085（2016）05-0014-05

2016-04-09

山东省现代产业技术体系家禽创新团队项目(SDAIT-13-011-10)；山东省省级引进国外智力项目。作者简介：于新友(1983-)，男，山东菏泽人，助理研究员，硕士，主要从事动物传染病诊断及防控研究。