MicroRNA-21相关靶基因的研究进展*

惠　越 综述，张　鑫，刘国跃，戢　慧，李　冲，陈　淼△ 审校

(1.遵义医学院重症医学科2病区，贵州遵义 563000；2.湖南省长沙市第三医院　410015)



MicroRNA-21相关靶基因的研究进展*

惠越1综述，张鑫1，刘国跃1，戢慧2，李冲1，陈淼1△审校

(1.遵义医学院重症医学科2病区，贵州遵义 563000；2.湖南省长沙市第三医院410015)

[关键词]miRNA-21；靶基因；细胞凋亡；潜在靶点

MicroRNA(miRNA)是一类新近发现的非编码小分子RNA，广泛表达于机体的各个组织和器官，主要通过与相关靶基因结合在转录后水平负性调控约60%的人类基因[1]。其中，miRNA-21在心脑血管、肝脏、肺脏、肾脏等多种疾病中异常表达，明确其所调控的靶基因对阐明miRNA-21的功能及在各种生命过程和疾病发生机制中的作用非常关键。目前鉴定靶基因最直接的方法是利用荧光定量PCR及Western blot方法分别检测转染或敲低miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变化,从而确定miRNA与靶基因的对应关系。这种方法可以大大提高准确率，但最终确定靶基因，还需要鉴定miRNA的靶位点。本文就目前国内外关于miRNA-21靶基因的研究进展作一综述。

1实验证实的miRNA-21靶基因

1.1PTENPTEN是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，定位于染色体10q23.3，全长约200 kb，它是一种具有磷酸脂酶活性的抑癌基因，其表达产物PTEN蛋白有403个氨基酸，是一个双特异性磷酸酶，能使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)脱磷酸形成磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸(PIP2)，使其丧失信号功能，从而阻断磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路，抑制细胞周期的进展，促进细胞凋亡[2-3]。其中，PTEN是这一信号通路中的“分子开关”，其失活必然激活PI3K/Akt通路[4]。相关研究已经证实miRNA-21在多种肿瘤细胞中介导PTEN的表达[5]。研究者通过对非小细胞肺癌和肺癌周围组织的研究发现，转染miRNA-21的抑制剂后，PTEN的表达明显上调，并且进一步证明了miRNA是通过与PTEN的3′ UTR端直接结合而抑制其表达[6]。Ou等[7]分别通过上调及降低miRNA-21在鼻咽癌CNE1和CNE2细胞系中的表达水平，发现miRNA-21可诱导鼻咽癌细胞生长并抑制细胞凋亡；进一步通过miRNA-21转染PTEN野生型及突变型荧光素酶报告基因载体，并以免疫印迹法检测PTEN和磷酸化Akt表达，验证了miRNA-21通过Akt信号通路抑制PTEN mRNA的表达。在创伤性脑损伤体外试验中，Wang等[8]证实了miRNA-21可通过PTEN/Akt信号通路，调节其下游凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2和Bax的表达水平来减少神经元细胞的凋亡，提供了新的创伤性脑损伤神经元凋亡的分子机制，并且提示miRNA-21可能为其治疗的潜在靶点。

1.2PDCD4程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4，PDCD4)最初于1995年在小鼠体内被发现，在小鼠体内大部分细胞发生凋亡时该基因表达上调，是目前已经证实的miRNA-21的靶基因之一。人PDCD4基因定位于10q24，全长3.5 kb。正常组织细胞中，PDCD4蛋白主要位于细胞核中，当细胞周围环境发生改变时，它可以通过核输出信号转移到细胞质中。PDCD4作为一种细胞凋亡基因在动物和人类肿瘤中被大量研究，其在胃癌、肝癌等肿瘤组织中表达明显下调，甚至缺失[9-10]。Ferraro等[11]在一组结肠肿瘤标本研究中，对miRNA-21、ITGβ4、PDCD4定量PCR数据集进行ROC曲线分析，结果显示，miRNA-21表达水平增高、ITGβ4、PDCD4表达水平降低，且3个基因组合能够预测结直肠癌的转移。研究认为PDCD4表达产物可在转录水平抑制细胞增殖从而抑制肿瘤的生长[12]。在宫颈癌hela细胞中转染miRNA-21抑制剂后，检测到细胞中PDCD4表达明显上升，进一步研究证实miRNA-21上存在一个与PDCD4 mRNA 3′ UTR相结合的位点，抑制miRNA-21可导致PDCD4的表达上调[13]。另外，Frankel等[14]对乳腺癌的研究中发现，在MCF-7细胞中导入外源性 miRNA-21抑制剂后PDCD4的表达明显上调。最近有研究证明，miRNA-21/PDCD4轴在细胞吞噬作用中发挥了重要作用，参与了死亡细胞的消化与清除。Das等[15-16]证实miRNA-21的表达水平在LPS激活的巨噬细胞中进一步增强，并通过PDCD4调节IL-10诱导物，从而影响细胞的吞噬作用。Wei等[17]在氧化应激损伤的心肌细胞中发现NF-κB正向调控miRNA-21的表达，且证明PDCD4是miRNA-21的直接作用靶点。此外，miRNA-21的过表达能保护ROS介导的心肌损伤。

1.3TPM1原肌球蛋白(tropomyosin，TPM)是肌肉收缩过程中重要的调节蛋白质，广泛分布于各种真核细胞中。原肌球蛋白1(tropomyosin 1，TPM1)属于这一家族中相对分子质量较高的一类，是肌肉收缩过程中重要的调节蛋白质。在对乳腺癌细胞MCF-7转染miRNA-21的研究中发现，重组人TPM1表达明显上调，其机制是通过miRNA-21与TPM1-mRNA的3′UTR结合，从而调节TPM1的表达。Zhu等[18]报道了TPM1基因序列中miRNA-21 潜在结合位点的序列，验证了TPM1 是miRNA-21的作用靶点，miRNA-21在转录后水平抑制TPM1表达。Wang等[19]同样证明TPM1 mRNA 3′-UTR是miRNA-21的直接作用靶点，miRNA-21通过TPM1来调节血管平滑肌细胞的功能。一些致动脉粥样硬化的因素可诱导缺氧诱导因子1(HIF-1)上调miRNA-21，再靶向作用于TPM1促进ASMC增殖，导致ASO形成。HIF-1/miRNA-21/TPM1通路可能在ASO的发病机制中发挥关键作用[19-20]。

1.4Sprouty1、Sprouty2Sprouty蛋白是一类软脂酰化磷蛋白，广泛表达于机体各个组织与器官。Sprouty有4个亚型，分别为Sprouty1、Sprouty2、Sprouty3和Sprouty4。研究发现，miRNA-21可在肿瘤组织中负性调控Sprouty蛋白家族的表达，后者可使受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)信号通路异常,引起组织生长发育失调、细胞异常增生和转化[21]。在对心力衰竭小鼠的研究中发现，miRNA-21可与Sprouty-mRNA相应的碱基对结合，从而导致Sprouty蛋白家族表达下调；进一步通过降低小鼠体内miRNA-21表达水平，可检测到Sprouty1蛋白的表达明显上调，从而有效地改善了患病小鼠的预后。其机制可能与Sprouty1蛋白对细胞外信号调节激酶(acellular signal-regulated kinase，ERK)信号通路的抑制相关[22]。miRNA-21还可提高成纤维细胞的生存率，导致心肌纤维化和功能障碍。房颤患者miRNA-21的表达增加，miRNA-21及Sprouty1在人心房肌的表达与心肌纤维化密切相关[23]。Bronnum等[24]研究表明miRNA-21促进心外膜间皮细胞向纤维上皮间质转化，其通过靶向作用于Sprouty1、PDCD4来调控调节心肌纤维上皮间质转化。Sayed等在结肠癌SW480细胞中转染miRNA-21的反义抑制剂来抑制miRNA-21表达，并通过相关方法检测到Sprouty2与miRNA-21直接靶向连接。miRNA-21通过靶向作用于PTEN和Sprouty2增强MAPK和Akt信号转导，并负性调节酪氨酸激酶受体信号转导[25]。在多发性骨髓瘤细胞中，Sprouty2通过抑制活化的MAPK /ERK通路来抑制肿瘤发展；通过转染抑制剂下调miRNA-21增加Sprouty2在多发性骨髓瘤细胞系的表达，证实miRNA-21调控Sprouty2的表达[26]。

1.5Fas配体(FasL)FasL是能够结合到死亡受体TNFRSF6/FAS的细胞因子，介导T细胞引起的凋亡。CTL细胞在活化后，识别靶细胞，细胞表面表达的高水平FasL与靶细胞表面的Fas相互识别，通过Fas触发靶细胞内部的凋亡程序，使靶细胞发生死亡。FasL的表达也受到了miRNA-21的调控。Wang等[27]指出Foxo3a 通过miRNA-21来调控FsaL 的表达。Foxo3a在阿霉素的介导下可以降低miRNA-21启动子的活性，荧光素酶实验结果显示miRNA-21可以抑制FasL转录活性。Shang等[28]在胶质母细胞瘤的研究中发现，过表达 miRNA-21在转录后水平抑制FasL蛋白表达；降低miRNA-21水平，则FasL蛋白表达增加。通过构建FasL 3′UTR野生型载体及突变载体，以荧光素酶实验证实，FasL为miRNA-21直接靶基因[28]。肿瘤表面过表达的FasL可诱导特异性激活的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)凋亡导致肿瘤免疫逃逸，促进肿瘤细胞增殖，侵袭和转移。Wu等[29]实验证实乳腺癌组织中FasL的表达与miRNA-21呈负相关，miRNA-21靶向调节FasL介导的细胞凋亡可能打破肿瘤免疫逃逸机制，使肿瘤的免疫治疗成为可能。

1.6TIMP3和RECKTIMP3和RECK是基质金属蛋白酶(MMPs)的负调控因子，也是miRNA-21的靶基因。肝细胞癌中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)诱导的miRNA-21的表达在转录后水平抑制MMP抑制剂RECK、TIMP3的表达，它能影响肝癌的进展和转移。HMGB1发出信号增加miRNA-21的表达，通过抑制RECK、TIMP3增强MMPs活性；抑制HMGB1高表达的肝细胞癌中miRNA-21水平，可减轻miRNA-21对其靶基因TIMP3、RECK的抑制，从而降低肿瘤MMPs的活性，最终阻碍肿瘤的进展[30]。体外培养的人结肠癌细胞中过表达的miRNA-21能显著下调RECK水平，通过其下调RECK、增加MMP2活性来调控基质miRNA-21诱导的肿瘤入侵[31]。黑色素瘤细胞径向生长期向垂直生长期的过渡与MMPs有关，TIMP3抑制MMPs的表达，可以减少某些肿瘤的恶性表达程度。miRNA-21抑制TIMP3表达，能促进黑色素瘤从径向生长期过渡到更恶性的垂直生长期，从而增加了肿瘤的侵袭性[32]。Zhou等[33]证实miRNA-21通过靶向作用于细胞凋亡的启动子TIMP-3，抑制神经细胞凋亡。TIMP-3 mRNA及蛋白在受损的背根神经元表达减少，而大脑皮层缺血会导致TIMP-3 mRNA及蛋白表达增加。这两种不同结果显示细胞的损伤与保护不仅与miRNA-21调控有关，还可能与中枢、外周神经细胞的再生能力有关。

2miRNA-21潜在的作用靶点

miRNA靶基因的验证工作量大，验证过程复杂，虽然近年国内外涌现出大量有关miRNA-21的研究，但已证实的miRNA-21直接靶基因并不多，对其靶基因的筛选和验证仍是今后研究的重点和难点。目前，常用的miRNA靶基因预测软件中数据较全面且更新较快的有miRBase、TargetScan、Pictar、miRecords、TarBase及miRTarBase。对这些数据库检索发现，miRNA-21预测靶基因集合生物通路富集性分析发现 P38 MAPK通路中EGFR、RASGRP3、NTF3、MAP3K1、TGFBR1等为miRNA-21的潜在作用靶点。miRNA-21可能通过调节这些基因间接调控MAPK通路，从而在调节AKI炎症中发挥重要作用。也可能通过调节ACVR2A、SMAD7、TGFBR1、BMPR2、MYC、PITX2 等靶标基因，从而调控P53信号通路，抑制AKI肾小管细胞的凋亡，对AKI起保护作用[34-35]。韩泽平等[36]在人类miRNA疾病数据库(HMDD)中寻得miRNA-21、miR-145、miR-221和miR-222为至今前列腺癌领域研究最多的miRNAs。运用miRwalk数据库查询得上述4个miRNAs的共同靶基因，再结合前列腺基因数据库(PGDB)查找前列腺癌相关基因，得到CDKN1A、PTEN、ERBB2、MYC、TP53、ESR1和BCL2等7个共同靶基因与前列腺癌密切相关。这些潜在靶点值得进一步研究。

3展望

综上所述，目前对于miRNA的研究已进入一个全新阶段。尽管现阶段已预测出许多miRNA-21直接调控的靶基因，但经证实的靶基因不多，且现有研究大多数为肿瘤方面研究，针对MODS及脏器保护方面研究并不多，应用于临床并得到临床验证的更是少之又少。miRNA-21在调控网络中所发挥的作用以及在疾病的诊断、治疗及预后中所具有的价值，有待进一步的探索。

参考文献

[1]Van Kouwenhove M,Kedde M,Agami R.MicroRNA regulation by RNA-binding proteins and its implications for cancer[J].Nat Rev Cancer,2011,11(9):644-656.

[2]Small EM,O′rourke JR,Moresi VA,et al.Regulation of PI3-kinase/Akt signaling by muscle-enriched microRNA-486[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(9):4218-4223.

[3]Poliseno L,Salmena L,Zhang J,et al.A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology[J].Nature,2010,465(731):1033-1038.

[4]Carracedo A,Alimonti A，Pandolfi PP.PTEN level in tumor suppression:how much is too little?[J].Cancer Res,2011,71(3):629-633.

[5]Wickramasinghe NS,Manavalan TT,Dougherty SM,et al.Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells[J].Nucleic Acids Res,2009,37(8):2584-2595.

[6]Zhang JG,Wang JJ,Zhao F,et al.MicroRNA-21 (miR-21) represses tumor suppressor PTEN and promotes growth and invasion in non-small cell lung cancer (NSCLC)[J].Clin Chim Acta,2010,411(11/12):846-852.

[7]Ou H,Li Y,Kang M.Activation of miR-21 by STAT3 induces proliferation and suppresses apoptosis in nasopharyngeal carcinoma by targeting PTEN gene[J].PLoS One,2014,9(11):e109929.

[8]Wang GH,Jiang XY,Pu HJ,et al.Scriptaid,a novel histone deacetylase inhibitor,protects against traumatic brain injury via modulation of PTEN and AKT pathway[J].Neurotherapeutics,2013,10(1):124-142.

[9]Wang Q,Sun Z,Yang HS.Downregulation of tumor suppressor Pdcd4 promotes invasion and activates both beta-catenin/Tcf and AP-1-dependent transcription in colon carcinoma cells[J].Oncogene,2008,27(11):1527-1535.

[10]Wang XY,Wei ZT,Gao F,et al.Expression and prognostic significance of PDCD4 in human epithelial ovarian carcinoma[J].Anticancer Res,2008,28(5B):2991-2996.

[11]Ferraro A,Kontos CK,Boni T,et al.Epigenetic regulation of miR-21 in colorectal cancer ITGB4 as a novel miR-21 target and a three-gene network (miR-21-ITGB4-PDCD4) as predictor of metastatic tumor potential[J].Epigenetics,2014,9(1):129-141.

[12]Yang HS,Jansen AP,Komar AA,et al.The transformation suppressor Pdcd4 is a novel eukaryotic translation initiation factor 4A binding protein that inhibits translation[J].Mol Cell Biol,2003,23(1):26-37.

[13]Yao Q,Xu H,Zhang QQ,et al.MicroRNA-21 promotes cell proliferation and down-regulates the expression of programmed cell death 4 (PDCD4) in HeLa cervical carcinoma cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,388(3):539-542.

[14]Frankel LB,Christoffersen NR,Jacobsen A,et al.Programmed cell death 4(Pdcd4)is an important functional target of the microRNA miR-21 inbreast cancer cells[J].J Biol Chem,2008,283(2):1026.

[15]Das A,Ganesh K,Khanna S,et al.Engulfment of apoptotic cells by macrophages:a role of MicroRNA-21 in the resolution of wound inflammation[J].J Immunol,2014,192(3):1120-1129.

[16]Sheedy FJ.Turning 21:induction of miR-21 as a key swith in the inflammatory response[J].Front Immunol,2015(6):19.

[17]Wei C,Li L,Kim IK,et al.NF-kappa B mediated miR-21 regulation in cardiomyocytes apoptosis under oxidative stress[J].Free Radic Res,2014,48(3):282-291.

[18]Zhu S,Si ML,Wu H,et al.MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin 1 (TPM1)[J].J Biol Chem,2007,282(19):14328-14336.

[19]Wang M,Li W,Chang GQ,et al.MicroRNA-21 regulates vascular smooth muscle cell function via targeting tropomyosin 1 in arteriosclerosis obliterans of lower extremities[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31(9):U353-2046.

[20]Baker AH.MicroRNA 21 shapes vascular smooth muscle behavior through regulating tropomyosin 1[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31(9):1941-1942.

[21]Lao DH,Chandram OS,Yusoff P,et al.Asrchomology inding sequence on the Cterminus of Sprouty2 is necessary for inhibition of the Ras/ERK pathway downstream of fibrob last growth factor receptor stimulation[J].J Biol Chem,2006,281(40):29993-30000.

[22]Thum T,Gross C,Fiedler J,et al.MicroRNA-21 contributes to myocardial disease by stimulating MAP kinase signalling in fibroblasts[J].Nature,2008,456(7224):980-984.

[23]Lavall D,Selzer C,Schuster P,et al.The mineralocorticoid receptor promotes fibrotic remodeling in atrial fibrillation[J].J Biol Chem,2014,289(10):6656-6668.

[24]Bronnum H,Andersen DC,Schneider MA,et al.miR-21 promotes fibrogenic Epithelial-to-Mesenchymal transition of epicardial mesothelial cells involving programmed cell death 4 and sprouty-1[J].PLoS One,2013,8(2):e56280.

[25]Montalban E,Mattugini N,Ciarapica RA,et al.MiR-21 is an Ngf-Modulated MicroRNA that supports ngf signaling and regulates neuronal degeneration in PC12 cells[J].Neuromolecular Med,2014,16(2):415-430.

[26]Wang JH,Zheng WW,Cheng ST,et al.Correlation between MicroRNA21 and sprouty homolog 2 gene expression in multiple myeloma[J].Mol Med Rep,2015,11(6):4220-4224.

[27]Wang K,Li PF.Foxo3a regulates apoptosis by negatively targeting miR-21[J].J Biol Chem,2010,285(22):16958-16966.

[28]Shang C,Guo Y,Hong Y,et al.MiR-21 up-regulation mediates glioblastoma cancer stem cells apoptosis and proliferation by targeting FASLG[J].Mol Biol Rep,2015,42(3):721-727.

[29]Wu MF,Yang J,Xiang T,et al.miR-21 targets Fas ligand-mediated apoptosis in breast cancer cell line MCF-7[J].Med Sci,2014,34(2):190-194.

[30]Chen M,Liu Y,Varley P,et al.High-Mobility group box 1 promotes hepatocellular carcinoma progression through miR-21-Mediated matrix metalloproteinase activity[J].Cancer Res,2015,75(8):1645-1656.

[31]Bullock M,Pickard K,Nielsen BS,et al.Deregulated stromal microRNA-21 and promotion of metastatic progression in colorectal cancer[J].Lancet,2014,383(1):30.

[32]Gartel AL,Martin DE,Latchana N,et al.Mir-21 enhances melanoma invasiveness via inhibition of tissue inhibitor of metalloproteinases 3 expression:in vivo effects of Mir-21 inhibitor[J].PLoS One,2015,10(1):e0115919.

[33]Zhou SL,Zhang SB,Wang YX,et al.miR-21 and miR-222 inhibit apoptosis of adult dorsal root ganglion neurons by repressing TIMP3 following sciatic nerve injury[J].Neurosci Lett,2015,586(1):43-49.

[34]李志辉，邓旭．MicroRNA-21-5p调控丝裂原活化蛋白激酶p38信号通路[J]．中华实用临床儿科杂志，2014，29(5)：375-379．

[35]邓旭，李志辉．hsa-miR-21-5p调控丝裂原活化蛋白激酶p38信号通路[J]．儿科药学杂志，2014，20(7)：1-5．

[36]韩泽平，何金花，黎毓光，等．生物信息学分析microRNA在前列腺癌中的调控通路[J]．现代肿瘤医学，2014，22(8)：1891-1894．

doi:·综述·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.041

* 基金项目：国家自然科学基金资助项目(8156010205)。

作者简介：惠越(1987-)，硕士，住院医师，主要从事肺保护方面研究。△通讯作者，E-mail:chengmiao64@163.com。

[中图分类号]Q522

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)08-1121-04

(收稿日期：2015-07-11修回日期：2015-12-26)