急性髓系白血病FLT3基因突变研究进展*

杨金荣 综述,曾　云△，于　明 审校

(1.昆明医科大学第一附属医院血液科/云南省血液病研究中心，昆明 650032；2.昆明医科大学分子临床医学研究院，昆明 650500)



急性髓系白血病FLT3基因突变研究进展*

杨金荣1综述,曾云1△，于明2审校

(1.昆明医科大学第一附属医院血液科/云南省血液病研究中心，昆明 650032；2.昆明医科大学分子临床医学研究院，昆明 650500)

[关键词]急性髓系白血病；酪氨酸激酶；内部串联重复序列；酪氨酸激酶结构域

急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia,AML)是由髓系造血干/祖细胞起源的一组在临床及遗传学上均有高度异质性的克隆性疾病，是成人急性白血病的主要类型，分类复杂，发病机制至今尚未完全明确。目前认为其发病机制主要包括染色体易位或缺失、原癌基因及抑癌基因突变等，但其独特的细胞遗传学和分子遗传学改变是分类的基础,对疾病诊断、预后分层、微小残留病灶监测，以及靶向治疗的开发等具有极为重要的意义。近年来人们在AML中发现了越来越多的分子异常，例如NPM1、FLT3的内部串联重复序列(FLT3-ITD)、C-KIT等基因突变，在AML的分层治疗中具有重要意义[1]，而FLT3/ITD是AML中最常见基因突变之一，该突变在AML发病机制中起驱动作用[2]，是提示预后不良的标志[3]，动态检测AML患者治疗前后Fms样酪氨酸激酶-3(FLT3)表达水平，可作为判断AML预后和监测微小残留病灶的一项指标。目前，在FLT3-ITD阳性AML患者治疗方面，化疗和自体干细胞移植的疗效均不理想，异基因造血干细胞移植的疗效尚存在争议，靶向治疗越来越受到人们的关注，也取得了一定疗效，然而随着耐药的出现，克服耐药的靶向药物治疗是人们面临的一大挑战，是治疗FLT3-ITD阳性的AML患者的新方向。现简要综述AML中FLT3基因突变的临床意义、检测方法及治疗的最新研究进展。

1FLT3基因结构与功能

FLT3是Ⅲ型受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase Ⅲ,RTK Ⅲ)家族成员之一,FLT3基因位于第13号染色体长臂(13q12),全长约为100 kb，包括24个外显子，其中有16个外显子与c-kit具有高度保守性。FLT3蛋白结构包括5个免疫球蛋白(Ig)样结构域组成的胞外区，1个近膜区结构域(JM)及胞内由激酶插入区分隔而成的两个酪氨酸激酶(TK1/TK2)区和1个C-末端结构域。有关研究表明,JM结构域对维持激酶催化中心空间结构稳定性起主要作用，对激酶活性有负调控作用。FLT3优先表达于定向造血干细胞的细胞表面,在正常造血及免疫系统发育中起着重要作用,其配体(FL)可以作为一种膜复合物或者可溶的形式表达在骨髓基质细胞上。FLT3结合FL后相互作用能导致受体形成二聚体、自身磷酸化及细胞基质的磷酸化，激活多种细胞内信号通路，调节造血细胞的增殖和分化。

2FLT3突变

2.1FLT3突变形式及致病机制1996年Nakao等首次报道AML患者FLT3的近膜区存在串联重复突变，随后多项研究报道，FLT3基因突变还存在累及酪氨酸激酶结构域(FLT3 tyrosine kinase domain，FLT3-TKD)的点突变。在AML患者中，FLT3-ITD和FLT3-TKD这2种突变类型可同时或单独存在，且两种突变均可活化FLT3酪氨酸激酶。

FLT3-ITD突变指近膜结构域插入氨基酸重复串联序列，通常发生在近膜区的精氨酸残基595附近。受体酪氨酸激酶(RTK)的近膜区有自身抑制的作用，氨基酸重复串联序列异常插入激酶结构域可导致FLT3在无配体结合的情况下发生二聚体化并持续自我磷酸化，且FLT3-ITD与野生型FLT3形成二聚体，引起非依赖配体的磷酸化，酪氨酸激酶活性增强，并激活STAT5、RAS/MAPK和PI3K/AKT下游信号转导途径，抑制C/EBPα和PU.1，转化生长因子依赖性细胞为生长因子非依赖性细胞，赋予细胞增殖和(或)存活优势[4]，促进细胞增殖分化并导致AML疾病的复发和难治[5]。

FLT3-TKD即为酪氨酸激酶结构域的激活中个别氨基酸的缺失或插入，主要突变类型为FLT3/D835和FLT3/I836，其突变位点都位于组成型激活环上，可以自身抑制ATP、底物和激酶活性中心的结合，改变了激活环的构象空间，导致激酶过度活化。此外还有较少见的氨基酸残突变，虽对预后影响不大，但对应用FLT3激酶抑制剂的治疗非常重要，因为多数FLT3抑制剂对点突变类型无效或活性较低，目前TKD突变与FLT3抑制剂耐药的相关性已引起研究者的关注。

2.2FLT3基因突变在AML中的临床特征目前研究显示，FLT3-ITD在成人AML中突变率为15%～30%[3-4，6]，而在CN-AML中突变频率为31%～45%[7-8]。在FAB分型中，FLT3-ITD突变在M3中阳性率最高，M5次之，M2、M6、M7的阳性率较低。FLT3-ITD突变常与其他特殊的细胞遗传学改变或基因的变异有关联,FLT3-ITD突变在伴有t(15；17)染色体异常的患者中发生率高，尤其是在同时伴有PML/RARa且mRNA缩短的M3变异型中，相关研究表明，与FLT3/WT的M3相比伴有FLT3-ITD突变M3患者外周雪白细胞计数高，但其完全缓解(CR)率、DFS、OS仍尚有争议，有待进一步研究。在伴t(6；9)易位的患者FLT3-ITD可高达90%[3],而伴t(8；21)易位或inv(16)的患者FLT3突变率较低，在预后较差的复杂核型和11q23，t(3；3)，t(9；22)，-5/del(5q)，-7/del(7q)中FLT3突变率也低[7]。另外，FLT3-ITD突变的AML患者还通常具有外周血WBC及骨髓原始细胞计数高、预后差、复发率高和生存率低等独特的临床特征。

FLT3-TKD基因突变在AML患者中突变率为5%～10%[3-5]，而在CN-AML和伴有inv(16)/t(16；16)的AML患者中突变率分别约为12%和24%[8]，罕见于预后不良的复杂核型。与FLT3-ITD相比较，TKD点突变无明显的高白细胞等临床特征。

2.3FLT3对AML预后的影响一系列研究已证明，FLT3-ITD是AML独立的预后因素。FLT3-ITD阳性的AML患者化疗后CR率低、疾病复发(RR)率高、总体生存期短、预后差[9]。目前，许多研究将FLT3-ITD突变特点分析得越来越细，主要包括突变序列长度、突变序列数目、突变序列插入位置以及突变等位基因含量，并将这些突变特点与预后相联系。Meshinchi等[10]研究提示，FLT3-ITD的长度是独立的预后不良因素，较长的ITD序列更易改变原激酶构象的自稳状态，影响其对治疗的反应。Kayser等[11]研究表明，非近膜区比近膜区FLT3/ITD突变的患者预后差，FLT3-ITD出现在TKD1的B1折叠区与低CR率有关。近年来定量PCR研究[12-13]表明，AML患者中突变等位基因含量与预后密切相关，其预后不良程度与突变基因/野生型基因比例呈正相关，RR、DFS和OS随其升高均有恶化趋势，FLT3/WT的缺失的FLT3突变患者预后更差，且高突变比例的AML患者中白细胞升高更加突出。研究还显示，AML患者的FLT3基因突变的拷贝量在诊断和复发时不同，高拷贝量的FLT3-ITD预测价值更大，提示预后更差。因此，动态监测AML患者治疗前后FLT3表达水平，可作为判断AML预后和监测微小残留病灶的一项指标。

TKD点突变是继ITD突变之后在AML患者中发现的FLT3基因的另一种突变形式，与AML患者预后的关系目前还存在争议。目前研究发现，多数FLT3激酶抑制剂(TKI)对FLT3-ITD阳性的AML患者有效，而对有FLT3-TKD突变的AML患者，其有效性也随TKD突变的多样性呈现多变性。Leung等[14]研究表明,FLT3-ITD与TKD双突变可能微量的存在FLT3抑制剂使用之前，在TKI选择性抑制FLT3-ITD后,TKD克隆逐渐成为主导地位而产生耐药，导致不良预后。

3FLT3基因突变的检测

2010年美国血液学会(American Society of Hematology)会议已明确提出FLT3-ITD基因突变检测可用于早期诊断难治复发、判断预后[15]。目前，FLT3-ITD突变检测已逐渐成为AML患者的常规检测项目。国内外文献报道[3，16]，FLT3-ITD突变的重复片段为3～400碱基不等。经典的琼脂糖凝胶电泳检测方法不足以分辨小于3个碱基的FLT3基因突变，直接测序法是检测FLT3突变的金标准，但过程繁琐，耗时较长，敏感性有限(约为20%～30%)。下面介绍几种目前最新的检测方法。

3.1聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)银染分析法PAGE法检测突变所依靠的是不同核酸分子的序列结构和长度差异，导致其在PAGE凝胶电泳中移动的速度不同。突变的双链核酸分子长度比未突变的双链核酸分子要长，在PAGE凝胶电泳中移动得慢，从而将突变检出。尤其变性PAGE在变性尿素作用下双链DNA变成单链，单链的电泳迁移率只由DNA长度决定，分辨率非常高，可达2 bp，常用于分离小于500 bp的DNA片段。PAGE操作相对简单，结果敏感可靠且成本低[17],采用银染法显色灵敏度高，可在基层医院开展初步筛查。但PAGE银染法结果受试剂及实验环境等因素影响较大，易出现检测失败、漏检等情况[18]。

3.2毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)法CE主要是根据单链DNA片段空间构象及所带电荷不同来检测突变。单链DNA片段的空间折叠构象复杂，主要由碱基相互作用力来维持，碱基发生改变时，将影响其空间构象，不同构象分子的表面所带电荷不同，从而可将突变与正常单链DNA区分开来。Lu等[18]报道CE检测无需凝胶，样品用量小，几乎不消耗溶剂，高效敏感且图像清晰，可区分1 bp的差异，操作简单且结果可靠，也可用于定量检测。CE检测还可同时检测多重PCR产物，保证其准确性的同时可提高FLT3-ITD突变的检出率。但其引物探针及CE仪器价格昂贵，在国内基层医院难以开展。

3.3微芯片电泳(microchip electrophoresis，ME)法ME的工作原理是突变的DNA片段空间构象及所带电荷不同，DNA分子在电场里泳动，荷正电的向负极运动，荷负电的向正极运动，经过一定时间的电泳，不同电荷的DNA分子被分开。其优势是微量、自动化，可采用荧光检测器检出。PCR-微芯片电泳可作为FLT3基因突变筛查的简便方法，但作为新的检测手段，其技术还未成熟，准确度有待于改进[19]。

3.4变性高效液相色谱技术(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)相对定量检测DHPLC相对定量检测方法是基于异源双链的形成，根据PCR产物变性复性后，形成了同源双链和异源双链，而异源双链由于碱基对不匹配，会在部分变性的温度条件下形成部分解链。由于单链DNA带负电荷减少，结合力弱，异源双链比同源双链先洗脱出来，可将同源双链和异源双链分离。因此，就可分离检测出由于ITD的插入而引起的FLT3基因长度多态性，可通过洗脱峰的面积计算进行定量分析。该技术方法稳定可靠、快速、准确，且具有高通量、高重复性、成本低、步骤简单等的特点。但突变等位基因含量极高时该法不如CE精确[16]。

4FLT3-ITD阳性的AML治疗进展

4.1FLT3基因突变的AML患者骨髓移植在治疗FLT3-ITD阳性AML患者方面，化疗和自体干细胞移植的效果均不理想，复发后再次诱导缓解时间长，缓解率低。为改善这组患者的预后，迫切需要新的治疗方案，而异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是否改变FLT3-ITD阳性的AML患者的预后仍有争议。成人AML(非急性早幼粒细胞白血病)中国诊疗指南(2011年版)中指出首次缓解后行allo-HSCT可作为该类患者一线治疗，可以提高该类患者的临床疗效[20]。但多个单中心的回顾性研究比较了FLT3-ITD阳性及FLT3-ITD阴性患者行allo-HSCT的疗效，发现allo-HSCT并不能完全改变FLT3-ITD阳性患者的不良预后[21-23]。而Lin等[24]也研究报道了，行allo-HSCT改善了FLT3-ITD阳性AML患者的预后，与未行allo-HSCT的FLT3-ITD阳性AML患者相比提高了无复发生存率，但与FLT3-ITD阴性AML患者相比仍有较高的复发率。

4.2FLT3基因突变的靶向治疗目前靶向药物治疗作为一种新的研究方向已引起了临床工作者的关注，针对AML的靶向药物多数是FLT3酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。目前将TKI分为两型：Ⅰ型和Ⅱ型抑制剂，Ⅰ型抑制剂可以结合未激活或激活的受体酪氨酸激酶的结构形式,而Ⅱ型抑制剂只结合未激活FLT3[25]。无论是Ⅰ型或Ⅱ型抑制剂,都可以抑制FLT3的下游信号关键通路促进白血病细胞的分化和凋亡。迄今为止,大多数FLT3 TKI研究主要是Ⅱ型属性,如Sorafenib(索拉非尼)、midostaurin(PCK412)、quizartinib(AC220)、lestaurtinib (CEP701)等,均可较强的抑制FLT3-ITD,但对FLT3-TKD、FLT3-ITD/TKD作用较小或无效，且在FLT3 TKI的临床试验中，已出现对FLT3 TKI耐药的病例,严重影响了FLT3 TKI的推广使用[2]。进一步研究其耐药机制发现，其耐药因素可能是以下几点：(1)受体内部机制，FLT3 TKI可诱导如D835和F691L等点突变，FLT3 TKI强效的抑制FLT3-ITD，使FLT3-TKD的克隆逐渐凸显出来而导致耐药的发生。这一点在体内和体外试验中均被证实[26]。且不同的FLT3 TKI诱导产生的耐药突变位点往往不同，如AC220和PKC412使用后出现F691、N676、D835而产生耐药[2]。(2)骨髓的微环境的保护，有关研究表明[27],部分骨髓基质细胞介导白血病细胞AKT、ERK和STAT3信号通路并持续激活及增强FL的表达,导致白血病细胞的长期生存和发展。且骨髓微环境也可减少体内对药物的敏感性,也可减弱PKC412和CEP701在抑制FLT3自身磷酸化的作用。(3)高水平的FLT3配体(FL)，近期的研究[28]显示，化疗如阿糖胞苷诱导治疗后血浆中FL的浓度显著增高，可减弱FLT3 TKI的功效也是导致FLT3 TKI耐药的重要因素之一。

目前克服耐药成为FLT3 TKI新的挑战,新一代应用前景较好的FLT3 TKI药物如：Crenolanib[25]、G-749[29]、TTT-3002[30]可强有力的抑制AML患者幼稚细胞FLT3-ITD、FLT3-TKD、FLT3-ITD/TKD突变包括TKI耐药基因(如：FLT3-D835H/Y、FLT3-ITD/F691L)，即使在复杂的骨髓微环境下，仍表现很强的抗白血病活性，但不影响正常的骨髓细胞。这使他们成为有前途新一代候选药物，但能否纳入一线治疗AML伴FLT3-ITD突变和(或)FLT3-TKD突变及治疗后出现点突变的患者仍需进一步研究。也有证据表明，单个FLT3抑制剂治疗维持时间短或部分有效，阻碍了FLT3-TKIs治疗[2]。因此,联合Ⅰ类型和Ⅱ类型TKI治疗FLT3阳性的AML患者可能是克服耐药，协同促进细胞凋亡，提高疗效的新选择。

5小结与展望

FLT3基因突变是AML患者常见的分子突变类型，在AML患者发病过程中可能起着十分重要的作用，而且与患者的治疗、预后密切相关。FLT3突变已逐渐成为AML患者的常规检测项目，其主要检测方法有PCR产物直接测序法、毛细管电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法及多重PCR结合毛细管电泳等，寻找到一种简便、低成本的检测方法，以便在基层医院开展筛查，提高检出率，有效评估患者的病情，更有针对性的治疗，提高疗效。目前FLT3突变的AML患者对常规化疗不敏感，allo-HSCT疗效尚有争议。因此，有效的靶向药物治疗成为临床治疗的新方向，对改善AML患者的治疗、预后有深远意义。

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doi:·综述·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.035

* 基金项目：国家自然科学基金资助项目(40110012)；云南省联合专项基金资助项目(2013FB122；2014FB027)；云南省卫生科技计划资助项目(2014NS167)。

作者简介：杨金荣(1986-)，硕士在读，主要从事血液系统疾病的研究。△通讯作者，E-mail：zengyun_fyy@sina.com.cn。

[中图分类号]R733.7

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)08-1104-04

(收稿日期：2015-09-17修回日期：2015-11-22)