智三针对AD模型大鼠脑内ChAT及GLUT3表达的影响*

黄健婷，崔韶阳，2，唐纯志△，罗晓舟，刘 明，卜正祥

(1.广州中医药大学针灸康复临床医学院，广州 510405; 2.深圳市福田区中医院康复科，广东 深圳 518034)

智三针对AD模型大鼠脑内ChAT及GLUT3表达的影响*

黄健婷1，崔韶阳1，2，唐纯志1△，罗晓舟1，刘 明1，卜正祥1

(1.广州中医药大学针灸康复临床医学院，广州 510405; 2.深圳市福田区中医院康复科，广东 深圳 518034)

目的:观察“智三针”对AD模型大鼠学习记忆能力、大脑皮质ChAT及GLUT3的影响，探讨针刺治疗AD的机制。方法:采用腹腔注射D-gal联合双侧海马注射Aβ1-40建立AD模型，按随机数字表法分为正常组、模型组、非穴组、智三针组各15只。记录大鼠Y迷宫测试全天总反应时间(TRT)以评估其学习记忆水平，采用免疫组化染色法检测大鼠脑皮质内ChAT、GLUT3的表达水平。结果:造模后，模型组、非穴组、智三针组大鼠的TRT较正常组均延长，4周治疗后与模型组、非穴组比较，智三针组大鼠TRT缩短;与正常组比较，模型组大鼠脑皮质ChAT、GLUT3表达水平均显著降低，与模型组、非穴组比较，智三针组ChAT、GLUT3表达水平均显著升高。结论:“智三针”能提高AD大鼠的学习记忆能力，其机制可能与升高大鼠脑内ChAT、GLUT3的表达有关。

智三针;阿尔茨海默病;胆碱乙酰转移酶;葡萄糖转运蛋白3;大鼠

阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，AD)是一种常见于老年人的中枢神经系统退行性疾病，以进行性的认知障碍、记忆障碍、失语、视空间技能障碍及精神病性症状等为主要表现。随着病情的发展，AD患者逐渐失去自理能力，家庭和社会都将承受巨大的情感和经济负担。因其复杂的病因病理不甚明了，到目前为止，对于 AD并没有特异性治疗方法［1］。近年来，针灸作为一种安全、有效、经济的治疗方法，越来越多地运用到 AD治疗中［2］。“智三针”由神庭穴、双侧本神穴组成，主要用于智力低下、精神障碍、记忆障碍等，在临床实践中，“智三针”能有效地改善患者的学习记忆、认知障碍等功能［3-4］，但其作用机制并不明确。

本实验采用腹腔注射D-半乳糖(D-gal)联合双侧海马区注射Aβ1-40建立AD大鼠模型，通过对大鼠进行Y迷宫测试及大鼠大脑皮质内胆碱乙酰转移酶(Choline acetyltransferase，ChAT)及葡萄糖转运蛋白3(Glucose transporter 3，GLUT3)水平的测定，探讨针刺“智三针”穴对AD模型大鼠学习记忆能力的影响及其作用机制，进而为针灸防治AD提供实验依据。

1 材料与器材

1.1 实验动物

SPF级健康 SD大鼠70只，雌雄各半，体质量200～250 g，购自中国中医科学院实验动物中心(动物合格证编号京SW2012069341)，于中国中医科学院SPF级动物实验室饲养，在相同条件下(温度21 ±2℃，湿度55±10%，12 h光照/12 h黑暗 循环)自由摄食、饮水。该实验经广州中医药大学动物实验伦理委员会审查合格(SPF20110032)。

1.2 主要实验器材与试剂

WDT-2型脑立体定位仪(西安西北光电仪器厂)、Y迷宫装置(河南原阳振华教学仪器厂)、石蜡包埋机、石蜡切片机(德国莱卡)、华佗牌针灸针(0.18×9 mm，苏州医疗用品厂有限公司)等。Aβ1-40(美国Sigma公司)、D-gal(上海化学试剂总厂试剂二厂)、水合氯醛分析纯(天津市大茂化学试剂厂)、ChAT试剂盒、GLUT3试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)等。

2 方法

2.1 AD模型的建立

70只大鼠按随机数字表法分为正常组15只(雄性8只，雌性7只)，造模组55只(雄性27只，雌性28只)。经适应性喂养1周后，造模组大鼠接受腹腔注射0.96%D-gal(5 ml/kg)，正常组大鼠腹腔注射生理盐水(5 ml/kg)，每天1次，连续6周。

6周后，造模组在第7周第1天接受双侧海马区注射Aβ1-40。将Aβ1-40肽段溶于无菌生理盐水中(5 g/L)，37℃孵育48 h备用。首先，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3 ml/100 g)，将大鼠固定于脑立体定位仪常规消毒，颅顶部正中切开皮肤，暴露颅骨露出前囟。参照 Paxinos＆Watson大鼠脑立体定位图谱［5］，选择双侧海马区为注射靶区(前囟后 3.5 mm，中缝旁开 2.0 mm，硬脑膜下 2.7 mm)，用牙科钻在颅骨对应位置钻开小孔，微量进样器垂直进针2.7 mm，在两侧海马区分别缓慢注入2 μL的 Aβ1-40，速度控制在 0.5 μL/min，留针 5 min，缓慢撤针以5 min为宜，缝合皮肤，术后采用抗感染(青霉素钠肌注3 d，每天1次)、保暖等措施。正常组大鼠海马区注射等量的生理盐水。2周后，将存活的符合模型标准的造模组45只大鼠纳入实验，按随机数字表法分为模型组、非穴组和智三针组各15只。

2.2 针刺方法

穴位定位参考李忠仁主编《实验针灸学》，“智三针”神庭穴取大鼠百会穴正中前下方2 mm处，神庭穴两侧旁开0.5 mm处为本神穴，大鼠双侧肋弓最低点上2 cm处取为非穴。采用针刺捻转手法，平补平泻，于每天上午进行，捻转频率为 80±5次/ min，幅度为180±5°，持续刺激2min休息1 min，如此反复，持续15 min。每天1次，每周6次，共4周。正常组、模型组不给予针刺，抓取固定15 min。

2.3 Y迷宫测试

Y迷宫测试将分别于大鼠造模成功1周后及针刺疗程结束后进行，保持周围环境安静、光线较暗，训练及测试时间固定，由专人负责。首先，将大鼠置于起步区，随机变换安全区与电击区，以训练大鼠辨别灯光刺激与安全区的能力。电击参数:电压50～70 V，持续5 s。安全区以Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ臂顺序变换，大鼠在电击区通电后10 s内一次性跑向安全区为正确反应，否则为错误反应。大鼠到达安全区后，灯光持续15 s，熄灯为结束1次测试，大鼠所在支臂为下一次测试起点，休息30 s后进行第2次测试，如此反复，每天训练20次。第1～3天为学习阶段，第4天测试记为短期记忆能力，第5天开始接受针刺等干预措施，第33天(针刺疗程结束后)测试记为长期记忆能力。将全天总反应时间(total reaction time，TRT)记为评估学习记忆能力的指标。

2.4 标本采集及检测

第33天Y迷宫测试之后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3 ml/100 g)，快速断头取脑，分离大脑皮质，经4%中性多聚甲醛溶液固定24 h，常规脱水、石蜡包埋，切片厚4 μm，按照试剂盒说明经免疫组化染色，每张切片在光镜下观察，随机观察每组大鼠同一部位切片，选择5个不重复视野，并利用全自动图像分析系统，测出每张切片内ChAT、GLUT3染色平均光密度和阳性面积率。

2.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行完全随机设计资料的方差分析比较各组间差异，P＜0.05为差异有统计学意义，Y迷宫数据、免疫组化结果均以(±s)表示。

3 结果

3.1 Y迷宫测试结果

表1显示，各组大鼠第4天(治疗前)及第33天(治疗后)TRT结果。治疗前与正常组比较，模型组、非穴组、智三针组大鼠的 TRT均延长(P＜0.05)，且模型组、非穴组、智三针组两两比较差异无统计学意义(P＞0.05)，说明 AD造模大鼠出现学习记忆能力减退。治疗后与模型组比较，非穴组与智三针组TRT均缩短(P＜0.05)，但是非穴组与其自身第4天比较差异无统计学意义(P＞0.05);与非穴组比较，智三针组TRT时间缩短(P＜0.05)，提示“智三针”能提高 AD模型大鼠的学习记忆能力。

表1 各组大鼠Y迷宫测试全天总反应时间TRT(±s)

表1 各组大鼠Y迷宫测试全天总反应时间TRT(±s)

注:与同时间点正常组比较:#P＜0.05;与同时间点模型组比较:*P＜0.05;与同时间点非穴组比较:△P＜0.05

组 别 鼠数 第4天(s) 第33天(s) 15 24.02± 9.58 21.82± 4.58模 型 组 15 37.77±14.09# 42.05±10.87非 穴 组 15 35.46±16.16# 33.08± 8.63*智三针组 15 37.40±14.26# 27.16± 6.67正常组＊△

3.2 大鼠大脑皮质ChAT、GLUT3的表达

表2显示，与正常组比较，模型组大鼠脑皮质ChAT、GLUT3平均光密度值及阳性面积率均显著降低(P＜0.01)，说明 AD模型大鼠脑皮质内 ChAT、GLUT3蛋白表达降低。经针刺治疗后，与模型组比较，非穴组与智三针组大鼠的ChAT、GLUT3平均光密度值及阳性面积率均有所升高，但是非穴组与模型组比较差异无统计学意义，而智三针组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。与非穴组比较，智三针组大鼠ChAT、GLUT3的平均光密度值及阳性面积率显著升高(P＜0.01)，说明“智三针”具有提高AD模型大鼠脑皮质ChAT、GLUT3蛋白表达的作用。

表2 各组大鼠大脑皮质ChAT及GLUT3蛋白表达的比较(±s)

表2 各组大鼠大脑皮质ChAT及GLUT3蛋白表达的比较(±s)

注:与正常组比较:##P＜0.01，与模型组比较:＊＊P＜0.01，与非穴组比较:△△P＜0.01

GLUT3平均光密度值 阳性面积率 平均光密度值 阳性面积率正 常 组组 别 例数 ChAT 15 2.46±0.55 5.66±1.36 2.47±1.29 7.48±1.85模 型 组 15 0.32±0.07## 1.97±0.24## 0.49±0.08## 3.17±0.73##非 穴 组 15 0.40±0.04 2.20±0.32 0.52±0.11 3.81±0.77智 三 针 组 15 1.17±0.26＊＊△△ 4.06±0.84＊＊△△ 1.25±0.23＊＊△△ 6.09±1.38＊＊△△

4 讨论

临床实践表明，针灸疗法对AD患者的智能及社会活动功能康复有积极作用。“智三针”包括神庭、双侧本神穴历代记载均为调神要穴。《淮南子·精神训》中说道:“神者，智之渊也。”头为精明之府，诸阳之会，脑为元神之府，主宰人的精神智力、思维、记忆和情感等。《针灸穴名浅解》中记载:“神庭，居处为庭。脑为元神之府，穴当天庭之上，为神的居处，主治烦闷恍惚，癫狂风痫诸疾。”本神穴，《针灸穴名浅解》谓其:“穴在前额发际，内应于脑……故善治有关神识诸病，如惊痫、癫风、神不归本等症，故名本神。”从现代医学角度，“智三针”位于前额头皮，内应大脑额叶，额叶功能与情感、认知、智力密切相关，故“智三针”在治疗神志疾患方面有其优势性。

本研究采用 D-gal腹腔注射联合双侧海马注射Aβ1-40建立 AD模型，一方面 D-gal腹腔注射可致大鼠出现与人类自然衰老相似的一系列生化改变、基因表达与调控异常、细胞退行性及行为学改变等;另一方面Aβ是 AD形成与发展的关键因素，联合 Aβ片段注射可使胆碱能神经元丧失功能，降低大鼠的学习记忆能力［6］。在 Y迷宫测试中，模型大鼠的TRT比正常大鼠延长，学习记忆能力受损。针刺疗程后，与模型组比较，智三针组TRT明显缩短，说明“智三针”能够改善 AD大鼠的学习记忆功能。

AD患者在临床上主要表现为记忆和认知功能障碍，中枢胆碱能系统参与学习记忆过程，AD的发生与胆碱能系统功能衰退关系密切［7］。乙酰胆碱(Acetylcholine，Ach)是胆碱能系统中参与学习记忆过程的重要神经递质，而ChAT是Ach合成过程中重要的酶，Ach由胆碱、乙酰辅酶A在ChAT的催化下合成。研究报道显示［8-9］，AD患者 Ach合成减少，ChAT的活性下降，且与痴呆的严重程度密切相关。本研究结果显示，AD模型大鼠较正常大鼠出现学习记忆减退症状，且大脑皮质ChAT蛋白表达较正常组显著降低，AD大鼠胆碱能系统受到损害。智三针组大鼠经过针刺治疗后，学习记忆能力得到改善，且ChAT蛋白表达较模型组、非穴组大鼠均显著提高，说明“智三针”能够提高AD大鼠脑皮质中ChAT表达，改善胆碱能系统功能。

在课题组前期研究中［10］，AD模型大鼠的相关病理脑区呈现出葡萄糖代谢降低的征象，而脑组织代谢所需能量几乎全部来源于葡萄糖。体内葡萄糖由血液通过血脑屏障进入脑细胞，需要葡萄糖转运蛋白(glucose transporter，GLUT)的参与，而脑内主要负责神经元葡萄糖转运的是 GLUT3［11］。已有研究发现，AD脑中GLUT3水平降低，可能导致脑葡萄糖摄取、代谢受损，进而影响脑功能状态。GLUT3的大量减少，使得被转入神经元的葡萄糖减少，能量供应不足加速神经元的退化及神经系统的衰老。本研究结果显示，AD大鼠大脑皮质GLUT3蛋白表达较正常大鼠显著降低，而智三针组大鼠GLUT3蛋白表达较模型组、非穴组大鼠均显著提高，说明“智三针”能够促进GLUIT3合成增加，加速神经元的葡萄糖摄入，改善脑内能量供应。

综上所述，“智三针”能够提高AD模型大鼠的学习记忆能力，其机制可能与改善胆碱能神经递质代谢、提高脑组织葡萄糖摄取从而改善能量代谢有关。“智三针”能在一定程度上改善 AD病理状态，但能否最终恢复至正常状态需进一步研究探讨。

［1］Huang Y，Mucke L.Alzheimer Mechanisms and Therapeutic Strategies［J］.Cell，2012，148(6):1204-1222.

［2］罗琴琴，杜艳军.针灸治疗阿尔茨海默病临床研究进展［J］.辽宁中医杂志，2014，41(3):594-597.

［3］李丹，周兆祥，刘志坚.针刺智三针和四神聪穴对脑外伤患者认知障碍的临床观察［J］.湖南中医药大学学报，2013，33 (5):99-102.

［4］江钢辉，陈振虎，赖新生.针刺智三针和四神聪穴治疗血管性痴呆的临床研究［J］.广州中医药大学学报，2003，20(4): 271-273.

［5］Paxinos G，Watson C.The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Compact，Sixth Edition［M］.Academic Press，2008:400.

［6］赵波，张新宇，付学锋.阿尔茨海默病动物模型的研究进展［J］.神经解剖学杂志，2012，28(1):102-104.

［7］邢宏义，孙圣刚.Alzheimer病的胆碱能系统研究进展［J］.国外医学·神经病学神经外科学分册，2000，27(5):262-264.

［8］Corey-Bloom J，Tiraboschi P，Hansen L A，et al.E4 allele dosage does not predict cholinergic activity or synapse loss in Alzheimer's disease［J］.Neurology，2000，54(2):403-406.

［9］Lopez O L，Hamilton R L，Becker J T，et al.Severity of cognitive impairment and the clinical diagnosis of AD with Lewy bodies［J］.Neurology，2000，54(9):1780-1787.

［10］卢阳佳，崔韶阳，陈俊琦，等.阿尔茨海默病模型大鼠脑葡萄糖代谢的PET影像特征［J］.山东医药，2011，51(29):27-29.

［11］Gould G W，Holman G D.The glucose transporter family: structure，function and tissue-specific expression［J］.Biochem J，1993，295(Pt 2):329-341.

Effect of Zhisan Needle on the Expression of Chat And Glut3 in the Brain of Ad Model Rats

HUANG Jian-ting1，CUI Shao-yang1，2，TANG Chun-zhi1△，LUO Xiao-zhou1，LIU Ming1，BU Zheng-xiang1
(1.Clinical Medical College of Acupuncture，Moxibustion and Rehabilitation，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China; 2.Department of Rehabilitation，Acupuncture＆Massage，Shenzhen Futian Hospital of TCM，Shenzhen 518034，China)

Objective:To observe the effects of acupuncture at Zhisanzhen on the learning and memory abilities and the expression of the ChAT and the GLUT3 of the cerebral cortex in Alzheimer’disease(AD)model rats.Methods:AD model rats were induced by intraperitoneal injection of D-gal and bilateral hippocampus injection of Aβ1-40.Y-maze task was applied to gauge the success of modeling and to assess the learning and memory abilities of the rats.The control group (n=15)，the model group(n=15)，the acupoints group(n=15)and the sham point group(n=15)were included.Rats in the acupoints group and the sham point group were needled one time per day for 15 min，6 days in one week，and 4 weeks in all.Immunochemistry staining was used to identify the expression level of the ChAT and the GLUT3.Results: The total reaction time(TRT)of the AD model rats were much longer compared with the control group at the same time point.After the 4-week acupuncture intervention，the TRT of the acupoints group was shorter than the model group and the sham point group.Compared with the control group，the expression level of the ChAT and the GLUT3 in the cerebral cortex were decreased significantly in the AD model rats.Compared with the model group and the sham point group，the expression level of the ChAT and the GLUT3 were improved in the acupoints group.Conclusion:Acupuncture at Zhisanzhen can improve the learning and memory abilities in AD model rats，and its mechanism may be related to the regulation of the expression of the ChAT and the GLUT3 in the cerebral cortex.

Acupuncture;Alzheimer’s disease;ChAT;GLUT3;Rats

R345.3

:B

:1006-3250(2016)07-0915-03

2015-12-11

国家自然科学基金面上项目(81173350)-运用 PET技术研究智三针对AD大鼠脑功能代谢的影响

黄健婷(1990-)，女，江西赣州人，在读博士，从事针灸治病机理的临床与研究。

△通讯作者:唐纯志(1966-)，男，湖南慈利人，教授，医学博士，从事针灸治病机理的临床与研究，E-mail:jordan664@ 163.com。