不同复合因素诱导对气虚血瘀模型建立的影响*

孙晓萍，周 军，常秀娟，王振中，萧 伟△

(1.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001;2.中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港 222001;3.江苏省企业院士工作站，江苏 连云港 222001)

【实验研究】

不同复合因素诱导对气虚血瘀模型建立的影响*

孙晓萍1，2，3，周 军1，2，3，常秀娟1，2，3，王振中1，2，3，萧 伟1，2，3△

(1.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001;2.中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港 222001;3.江苏省企业院士工作站，江苏 连云港 222001)

目的:对不同复合因素诱导的气虚血瘀模型进行研究，探讨模型建立的要点。方法:采用复合因素诱导方法造模，其中限食加强迫游泳为第1种复合因素造模方法，限食、强迫游泳加皮下注射肾上腺素为第2种复合因素造模方法，考察2种造模方法对不同性别大鼠体征及微观指标影响的差别。结果:与正常组比较，2种造模方法均使大鼠体质量减轻，耐疲劳时间减少，免疫功能降低，全血黏度增加，内皮功能紊乱。与第1种方法比较，第2种方法造模后大鼠耐疲劳时间、体质量及胸腺指数下降更为明显。与雌性大鼠比较，雄性大鼠耐疲劳时间长，胸腺及脾脏指数偏小，IL-4、IFN及VEGF水平偏低。结论:2种造模方法都可成功形成气虚血瘀证，皮下注射肾上腺素后雄性大鼠对其反应更为敏感。建议在采用该方法造模时雌雄分开，或使用单一性别，此外在本实验中发现不同性别SD大鼠具有免疫差异，且血清VEGF水平也有显著差异。

气虚血瘀模型;限食;强迫游泳;盐酸肾上腺素;性别;

气虚血瘀模型作为证候动物模型，已运用到脑血管病、肾病、心脏病、肺病、胃病的气虚血瘀证模型中［1-2］，用于从中医病因病机角度阐释中药对机体的作用机理，同时常采用微观和宏观指标阐明疾病过程及用药过程中症状或生物标记物质的改变。根据现有文献［3］，以单一因素或复合因素进行气虚血瘀模型建立的方法不下7种，其中饥饿、疲劳和游泳因素为气虚血瘀模型中常见的诱导因素，而高脂饮食、寒湿、外伤、肾上腺素、高分子右旋糖酐等因素可使机体血液呈黏滞状态用于辅助建立血瘀证候，肾上腺素则因价格低廉、剂量及给药方法容易掌握，建模时多采用该法。对于受试动物的选择，各报道也未达成一致，造模过程中更多采用雌雄兼用，但也有认为不同性别大鼠血液流变学差异较大而使用单一性别的［4-6］。笔者在实验过程中发现，动物性别及肾上腺素的使用对实验不同指标具有较大影响，致使药效结果的评价容易出现较大分歧，因此将以上2种因素纳入考察范围，为模型完善提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

SPF级SD大鼠雌雄兼用62只，体质量200～220 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供(合格证号SCXK(苏)2013-0016)，按随机数字表法分为雌性正常组、模型Ⅰ组(雌性，只执行强迫游泳)、模型Ⅱ组(雌性，执行强迫游泳及肾上腺素皮下注射)、雄性正常组、模型Ⅲ组(雄性，只执行强迫游泳)、模型Ⅳ组(雄性，执行强迫游泳及肾上腺素皮下注射)6组，每组 9～12只，大鼠分笼饲养，每笼5～6只。

1.2 试剂与仪器

盐酸肾上腺素注射液1 mL，北京市永康药业有限公司(批号12100241);血栓素B2(TXB2)、前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)、内皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)、VEGF(血管内皮生长因子)、TGF-β(转化生长因子)、IL-4(白介素)、IFN(干扰素)放免疫试剂盒，北京华英生物有限公司(批号20150120);水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司。

赛科希德 SA-9000全自动血流变检测仪;r—911全自动放免计数仪(中国科技大学实业总公司生产);5804R Eppendorf冷冻离心机。

1.3 实验方法

正常组大鼠常规饲养，给予充足食水，其他组大鼠限食不限水，每日摄取正常食量的1/3(每笼大鼠每日添加饲料60～70 g)［7］，第7天将所有模型组大鼠放入水深35 cm的恒温水槽(温度14℃ ～16℃)中游泳，当全组 50% 的大鼠出现自然沉降时，全部停止游泳，如此连续游泳20 d，第26天记录耐疲劳时间。模型Ⅱ组和模型Ⅳ组则在实验第16天皮下注射0.1%肾上腺素0.4 mL·kg－1，每天1次，连续10 d。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 疲劳时间测定 从大鼠入水至其自然沉降3次所需时间。

1.4.2 血液流变学检测 第27天大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血4 ml，肝素抗凝，测定在不同切变率下的全血黏度。

1.4.3 生物标记物及脏器指数 腹主动脉取血4 mL，3000 r/min 4℃离心10 min，取上层血清－80℃保存，放免法检测血栓素B2(TXB2)、前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)［8，11］、内皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)、血管内皮生长因子(VEGF)［9，11］、白介素4 (IL-4)、(干扰素)IFN-γ等指标;大鼠放血处理后取胸腺及脾脏称重并计算脏器指数。胸腺指数=胸腺质量(mg)×10/体质量(g)，脾指数=脾质量(mg) ×10/体质量(g)。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，统计数据以均数 ±标准差(±s)表示，定量资料采用Kolmogorov-Smirnova进行正态性检验，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量、耐疲劳时间、胸腺和脾脏指数及免疫因子

表1显示，与正常组比较，模型组大鼠耐疲劳时间显著缩短，体质量显著减轻，胸腺及脾脏指数均显著下降(P＜0.05，P＜0.01)，提示2种复合因素诱导下的模型大鼠均出现气虚乏力体征，免疫功能也出现缺陷。增加皮下注射肾上腺素这一诱导因素后，雄性动物中，模型Ⅳ组耐疲劳时间和体质量显著降低，胸腺指数明显减少，与模型Ⅲ组比较差异有统计学意义(P＜0.01);雌性大鼠中，模型Ⅱ组IL-4产生显著增多(P＜0.01)，提示 Th1/Th2细胞失衡，免疫功能破坏。正常大鼠中，与雌性正常大鼠比较，雄性正常组胸腺及脾脏指数明显偏小(P＜0.01，P＜0.05)，IL-4及IFN-γ水平明显偏低(P＜0.05)。

表1 各组大鼠体质量、耐疲劳时间、胸腺和脾脏指数及免疫因子比较(±s)

表1 各组大鼠体质量、耐疲劳时间、胸腺和脾脏指数及免疫因子比较(±s)

注:与雌性正常组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与雄性正常组比较:++P＜0.01;与模型Ⅲ组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01

性别 组 别 例数 游泳时间 体质量 胸腺指数 脾脏指数 IL4 IFN-γ正 常 组 11 128.18± 9.18 232.36±13.63 22.00±3.11 21. 7.77±0.58 40.45±12.31 62±3.07 8.23±0.57 58.46±10.39雌性 模型Ⅰ组 12 39.92±19.53＊＊ 155.75±12.23＊＊ 6.09±3.01＊＊ 13.31±2.91＊＊ 8.53±0.54 48.49±12.27模型Ⅱ组 10 36.00±20.07＊＊ 158.40±15.30＊＊ 6.56±2.74＊＊ 13.80±3.52＊＊ 8.84±0.54＊＊48.44±17.34正 常 组 10 175.20±14.79* 294.30± 8.56＊＊ 14.08±1.82＊＊ 18.52±1.53* 7.70±0.55* 45.42± 7.82*雄性 模型Ⅲ组 9 83.44±32.88++ 222.22±23.00++ 4.82±2.15++ 12.96±2.99++8.20±0.50 37.65± 7.56模型Ⅳ组 9 49.78±14.18++△△ 204.78±16.84++△△ 2.05±1.34++△ 10.59±2.18++

2.2 各组大鼠血液流变学指标

表2显示，与正常组比较，模型组不同切变率下的全血黏度均比空白对照组升高(P＜0.01)，红细胞聚集指数与卡松黏度与正常组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.3 血管及内皮功能调控因子

表3显示，与正常组比较，模型组大鼠TXB2/6-Keto-PGF1α比值均升高(P＜0.01)，提示2种复合因素诱导下的模型方法均能引起 TXB2、6-Keto-PGF1α含量的明显变化，TXB2/6-Keto-PGF1α平衡失调，内皮功能障碍，其中模型Ⅲ组和模型Ⅳ组6-Keto-PGF1α含量显著降低(P＜0.05)，模型Ⅰ组及模型Ⅱ组一氧化氮含量明显下降，模型Ⅲ组一氧化氮含量明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示大鼠内皮舒张功能异常［8］。与雌性正常大鼠比较，雄性大鼠VEGF含量明显偏低(P＜0.05)。

表2 各组大鼠血流变比较(±s)

表2 各组大鼠血流变比较(±s)

注:与雌性正常组比较:＊＊P＜0.01;与雄性正常组比较:++P＜0.01

性别 组 别 例数 1s－1 30 s－1 50 s－1 200 s－1红细胞聚集指数 卡松黏度雌性 正 常 组 11 25.55± 2.33 5.72±0.33 5.09±0.28 4.11±0.206.21±0.33 3.22±0.13模型Ⅰ组 12 69.93±33.88＊＊ 9.46±2.91＊＊ 7.94±2.29＊＊ 5.57±1.33＊＊ 11.31±3.32＊＊ 3.60±0.89模型Ⅱ组 10 85.20±43.62＊＊ 10.50±3.22＊＊ 8.65±2.40＊＊ 5.90±1.26＊＊ 13.54±4.26＊＊ 3.60±0.50雄性 正 常 组 10 34.14± 4.82 6.39±0.45 5.58±0.36 4.31±0.26 7.92±0.98 3.21±0.21模型Ⅲ组 9 125.70±31.54++ 14.14±0.96++ 11.49±0.74++ 7.58±0.84++ 16.10±3.38++ 4.41±0.81++模型Ⅳ组 9 115.79±14.55++ 13.36±1.14++ 10.88±0.91++ 7.21±0.62++ 15.71±1.84++ 4.41±0.47++

表3 各组大鼠血管及内皮功能调控因子比较(±s)

表3 各组大鼠血管及内皮功能调控因子比较(±s)

注:与雌性正常组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与雄性正常组比较:+P＜0.01，++P＜0.01

性别 组 别 例数PGF TXB TXB/6K NO ET VEGF雌性 正 常 组 11 111.51±11.81 112.77±23.07 1.02±0.22 44.7 64.07±11.46 0.60±0.18 8±7.56 73.16±14.48 0.68±0.17模型Ⅰ组 12 105.22±13.05 131.60±33.24 1.26±0.31* 36.56±7.75＊＊ 75.25±16.32 0.66±0.17模型Ⅱ组 10 106.95±13.63 135.02±22.89 1.26±0.17* 35.38±1.60＊＊ 74.95±12.73 0.64±0.19雄性 正 常 组 10 117.32±16.30 107.83±26.18 0.93±0.23 41.82±7.08 63.16±10.41 0.49±0.12*模型Ⅲ组 9 102.29±11.18+ 129.71±31.41 1.26±0.24++ 39.27±7.92 74.61±17.94 0.51±0.15模型Ⅳ组 9 103.59±11.03+ 127.84±27.79 1.22±0.18++ 35.65±2.07+

3 讨论

以上2种复合因素造模方法都可成功地形成气虚血瘀证，大鼠表现为体质量减轻，耐疲劳时间缩短，细胞免疫功能显著降低，血药流变呈低黏状态、血管及内皮细胞功能紊乱，与文献报道基本一致［12］。肾上腺素作为血小板聚集的强诱导剂［13］，可造成血小板聚集、末梢血管收缩、外周阻力增加，使得该证候成模率更高。本研究将皮下注射肾上腺素及性别作为造模影响因素分别进行评价，旨在明确这2个因素对模型微观指标的影响。结果显示，雄性大鼠中，皮下注射肾上腺素后大鼠的耐疲劳时间及体质量下降更为明显，胸腺指数也明显下降;雌性大鼠中，除血清IL-4水平有显著差异外，2种造模方法对微观指标的影响均无差异，提示雄性大鼠对肾上腺素更为敏感，在采用限食、强迫游泳、皮下注射肾上腺素综合因素造模时，宜雌雄分开或使用单一性别。

已有报道发现，大鼠在免疫病变［14］或免疫指标［15］方面有性别差异。郑国强［16］等也发现，雌性小鼠的胸腺质量和胸腺指数均大于雄性小鼠，雌性小鼠脾小体的形态结构也比雄性小鼠更完整。提示雌雄小鼠之间存着免疫差异，特别是胸腺方面。本次实验发现，免疫差异也存在于大鼠中。实验还发现，除免疫指标外，雌性或雄性造模大鼠的体质量、耐疲劳时间、血液流变学指标、TXB2/6-Keto-PGF1α的比值并无明显差异，因此在不考虑免疫功能的前提下，气虚血瘀模型建模时可以不必考虑性别因素对模型的影响，药效学评价时也可雌雄兼用。需要考察药物对免疫功能的影响时应考虑性别差异，避免数据上的假阳性或假阴性。

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Effects of Different Compound Factors on the Establishment of Qi Deficiency and Blood Stasis Model

SUN Xiao-Ping1，2，3，ZHOU Jun1，2，3，CHANG Xiu-juan1，2，3△，WANG Zhen-zhong1，2，3，XIAO Wei1，2，3
(1.Jangsu Kanion pharmaceutical Co.，Ltd，Lianyungang 222001，China; 2.State Key Laboratory of Pharmaceutical New-tech for Chinese Medicine，Lianyungang 222001，China; 3.Enterprises Academician Workstations in Jiangsu Province，Lianyungang 222001，China)

Objectives:To research the effect of different composite factors on Qi-deficiency and Blood-stasis model and determine the major points of model.Method:The rat models were induced by diet restriction，forced swimming or adrenalin by subcutaneous injection.One model was induced by diet restriction，forced swimming，another model was induced by diet restriction，forced swimming and adrenalin by subcutaneous injection.The signs and microcosmic index of model rats in different gender groups were observed.Results:Compared with normal group，the body weight was decreased，time of fatigue resistance was increased，immune function was decreased，and endothelial function was imbalanced in each model group.Compared with model group induced by first composite factors，model group added adrenalin by subcutaneous injection were observed less body weight，time of fatigue resistance and thymus index.The male rats were founded longer time of fatigue resistance，less of thymus and spleen index，lower level of IL-4，IFN and VEGF than female rats.Conclusion:Two modeling methods can successfully make Qi-deficiency and Blood-stasis syndrome.The male rats have more sensitive reaction after subcutaneous injecion of adrenalin，therefore we advise that rats model should be male and female apart，or using a single gender.Experiments found in SD male rats immune difference，and the serum VEGF levels have significant differences.

Qi-deficiency and Blood-stasis model;Diet restriction;Forced swimming;Adrenaline;Gender

R-33

:B

:1006-3250(2016)07-0901-03

2015-11-20

现代中药创新集群与数字制药技术平台(2013ZX09402203)

孙晓萍(1981-)，女，湖北人，工程师，医学硕士，从事药物作用机制与药物代谢研究。

△通讯作者:萧 伟(1959-)，男，高级工程师，医学博士，从事中药新剂型的研究与开发，Tel:0518-85521956，E-mail: wzhzh-nj@tom.com。