右归丸抑制肾阳虚型慢性再生障碍性贫血患者Th17细胞活化的观察*

高 锋，官菊梅，，安雪梅

(1.四川中医药高等专科学校，四川 绵阳 621000;2.成都中医药大学，成都 610075)

右归丸抑制肾阳虚型慢性再生障碍性贫血患者Th17细胞活化的观察*

高 锋1，官菊梅1，2，安雪梅2

(1.四川中医药高等专科学校，四川 绵阳 621000;2.成都中医药大学，成都 610075)

目的:探讨右归丸对肾阳虚型CAA患者外周血中Treg/Th17细胞功能的调节作用。方法:对2组肾阳虚型 CAA患者进行干预，其中加服右归丸设为观察组，另为对照组，均治疗30 d比较2组患者治疗前后Th17细胞百分比、p-STAT3、SOCS3、IL-6、IL-17、IL-23及 RORγt的表达变化。结果:治疗前后 CAA患者外周血 Th17细胞百分率、IL-6、IL-17、IL-23、p-STAT3以及RORγt水平均高于健康对照组，治疗后观察组上述指标低于对照组，SOCS3表达则与上述指标趋势相反。结论:右归丸在抑制Th17细胞介导的炎症反应过程中具有重要作用，它通过抑制STAT3信号发挥作用，为自身免疫性疾病提供治疗靶点。

慢性再生障碍性贫血;肾阳虚;Th17细胞;流式检测技术

再生障碍性贫血(aplastic anemia，CAA)是1组由多种病因所致的骨髓功能障碍、以全血细胞减少为主要表现的综合征。Zheng M于2012年进行的1项多中心、大样本研究发现，CAA的发病机制与免疫系统功能紊乱密不可分［1］，主要表现为 T淋巴细胞网络的失衡以及免疫活性分子的异常激活，导致造血环境的破坏。CD4+T细胞在免疫反应中起重要调节作用，在特异性抗原刺激下被激活，并增殖分化为不同的效应T细胞亚群，如调节性 T细胞(Treg细胞)及 T辅助 17型细胞(Th17细胞)。已有文献证实，Th17细胞比率升高在CAA的发生发展过程中发挥着主要作用，但导致Th17细胞在CAA中过度活化的免疫调节机制尚未明确［2］。而转录激活因子 3(signal transducers and activators of transcription3，STAT3)在 CD4+T细胞向Th17细胞的分化过程中起重要作用，细胞因子 信 号 抑 制 因 子 3 (suppressors ofcytokine signaling 3，SOCS3)能下调 STAT3的表达，进而抑制 Th17细胞的活化聚集［3-4］。

西医学采用免疫抑制剂、造血刺激因子等方法综合治疗，经济花费高昂，且免疫抑制的副作用给病人带来极大痛苦，从而使不少患者无法继续治疗，因此寻求新的治疗方案具有现实意义。近年来，中草药因能提高免疫功能且毒性低等特点受到广泛关注。通过文献研究发现，肾阳虚型是CAA中发生率较高的证型，故我们采用温补肾阳的右归丸对肾阳虚证型 CAA患者进行治疗，并尝试探讨该方药对患者外周血中 Th17细胞功能的调节作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采集2007年1月至2013年3月成都中医药大学附属医院门诊及住院部收集的 CAA患者资料，根据中国医药科技协会2002年《中药新药临床研究指导原则(试行)》将符合肾阳虚的CAA患者56例按随机数字表法分为对照组和观察组各28例。其中男性 30例，女性 26例，年龄 1～71岁，平均年龄(39±6.9)岁，所有患者诊断均符合张之南主编《血液病诊断及疗效标准》(第三版)中关于 CAA的诊断标准，所有患者均为原发性CAA，排除药物、化学品、辐射、感染等导致的继发性CAA，排除骨髓纤维化、急性白血病等引起全细胞减少的疾病。同期健康体检者30例作为健康对照组，其中男性 19例，女性 11例，年龄 2～70岁，平均年龄(40±5.8)岁。本研究方案经过医院伦理学委员会审查批准，所有受试对象均签署知情同意书。

1.2 治疗方法

对照组与观察组均口服再造生血片(辽源誉隆亚东药业有限责任公司，国药准字Z22025856)，其主要成分为蚕砂提取物)1.9 g，tid，观察组在上述治疗方法基础上口服右归丸(京同仁堂股份有限公司同仁堂制药，国药准字Z11021040)9 g，tid(用法参照说明书进行)，2组均以30 d为1个疗程。

1.3 流式细胞检测

1.3.1 主要试剂与仪器 RPMI 1640和胎牛血清(美国Thermo公司);人淋巴细胞分离液 (天津市灏洋生物制品科技有限责任公司);佛波酯(PMA)、离子霉素(Ion)、莫能菌素(Mon)、破膜剂、酶标仪、CD4-FITC、IL-17A-APC流式抗体、流式细胞仪(Partec GmbH德国，产品型号YZB/GEM 946-40);人细胞因子 IL-6、IL-17、IL-23 ELISA试剂盒(美国 eBioscience公司);兔来源 p-STAT3及SOCS3抗体(美国CST公司)。

1.3.2 Th17细胞流式检测 取健康对照组、CAA患者治疗前及治疗1个月后前臂外周抗凝血5 ml，用人淋巴细胞分离液提取外周血单核细胞(PBMC，1×106/ml)200 ul，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，加入刺激剂佛波醇乙酯(PMA)及离子霉素、莫能霉素等工作液并混匀，置于37℃、5%CO2培养箱中培养4～6 h。用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗、离心收集细胞，加入5 ul异硫氰酸荧光素标记的CD4(CD4-FITC)、5ul藻红蛋白标记的IL-17(IL-17A-APC)，操作按试剂盒说明书进行，采用流式细胞仪检测Thl7细胞。

1.3.3 细胞因子检测 将适量流式细胞仪(FCM)筛选的 Th17细胞液在 4℃条件下进行3000×g离心 5 min后用高压枪头吸取离心的上清液，使用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测，利用抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合原理进行相关因子浓度的检测。具体步骤如下:用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10 μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1 ml，4℃过夜。次日弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3 min。加一定稀释的待检样品0.1 ml于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1 h然后洗涤。同时做空白孔、阴性对照孔及阳性对照孔，随后在各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1 ml，37℃孵育 0.5～1 h，洗涤。再于各反应孔中加入临时配制的 TMB底物溶液0.1 ml，37℃10～30 min，于各反应孔中加入 2 M 硫酸0.05 ml。试剂盒由广州达安基因股份有限公司提供，显色后采用492 nm波长，TMB反应产物检测需要450 nm波长。检测时定要首先进行空白孔系统调零，用测定标本孔的吸收值与1组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示。以空白对照孔调零后测各孔 OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍即为阳性。操作过程全部按照试剂盒说明书进行。

1.3.4 磷酸化信号传导与转录激活因子 3 (p-STAT3)、细胞因子信号抑制因子3(SOCS3)及维甲酸相关孤独受体 γt(RORγt检测) 无菌条件下取观察组、对照组治疗前后以及健康体检组髂后上棘或髂前上棘骨髓液5 ml，置于存在EDTAK2溶液中，用人淋巴细胞分离液提取外周血单核细胞(PBMC，1×106/m1)200 ul，置于含10%胎牛血清及90%的DMEM培养基中，静置于5%CO2、饱和湿度37℃恒温培养箱中培养7 d，随后用0.25%的胰蛋白酶 +0.02%的 EDTA进行细胞消化，随后10000 r/min离心后弃上清液，在加入完全培养液后按照5×104/ml密度接种于培养瓶中进行细胞传代后再次按照上述步骤消化细胞，离心弃上清液后所得细胞置于－80℃冰箱待检测。

①蛋白印迹法(Western-blot法)测定蛋白水平变化:收集适量流式细胞仪筛选的Th17细胞置于1 mLEP管后用 PBS洗涤2遍。然后加入细胞裂解液，充分裂解后置于4℃ 12000 r/m离心机离心10 min，取上清液获取总蛋白。考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳分离蛋白后转印到硝酸纤维膜上，封闭后加入相应的单抗轻摇孵育1.5 h。用PBS洗涤3次，接着加入 HRP-二抗，置于室温轻摇1 h后取出，再用 PBS洗涤3次，最后进行曝光、显影、定影、拍照和统计分析;②荧光多聚酶链式反应(Real-Time PCR法)测定基因水平变化，用于检测 RORγt mRNA的表达:按照 Trizol试剂说明书提取流式细胞仪筛选的 Th17细胞RNA，按照 Reverse transcriptase first stand cDNA synthesis试剂盒说明书进行进行逆转录。逆转录过程:95℃(6 min)→55℃(90 s)→72℃90 s)→72℃(10 min)→5℃(1 h)。Real-Time PCR操作方法按照试剂盒说明书，使用 GAPDH作为内部参照，将 GAPDH的拷贝数作为校正基数，通过ABI7500软件获得检测指标 Ct(cycle threshold)值，与同样本中GAPDH的Ct值相减，即获得该样本中相应指标的 ΔCt值。以假手术组 ΔCt值作为校正，软件根据2-ΔΔCT数值计算出检测指标基因浓度水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS统计软件进行统计分析，计量资料以均数 ±标准差(±s)表示，且均符合正态性。两独立样本均数间比较采用 t-test，随机分组设计资料采用单因素方差分析，方差分析前使用Levene检验方差齐性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组治疗前后外周血象比较

表1显示，经过治疗后2组患者外周血象均有改善，与治疗前比较差异有统计学意义(P＜0.05)，其中口服右归丸的观察组改善较常规治疗对照组明显(P＜0.05)。

表1 2组治疗前后外周血象变化情况(±s)

表1 2组治疗前后外周血象变化情况(±s)

注:与治疗前比较:*P＜0.05，与对照组治疗后比较:#P＜0.05

组 别 例数 时 间 HGB(g/L) WBC(X109/L) PLT(X109/L) 49.2±6.42 2.5±0.39 46.7±6.21治疗后 88.6±5.64*# 3.6±0.31*# 67.3±5.91*#对照组 28 治疗前 50.1±5.93 2.6±0.36 47.1±2.68治疗后 60.6±7.12* 2.9±0.32* 51.4±2.01观察组 28 治疗前*

2.2 右归丸能显著抑制 CAA患者外周血中Th17细胞的表达

对不同治疗组患者外周血进行流式细胞术检测CD4+IL-17+结果显示，右归丸治疗组治疗后CD4+IL-17+T细胞百分率(0.895±0.309)%显著低于治疗前(0.895±0.309%vs 2.556±0.491 %，|t|=22.07，P=0.0008＜0.001)及对照组治疗后(0.895±0.309% vs 1.262±0.247%，|t| =3.676，P=0.009＜0.01)，且高于健康对照组(0.895±0.309% vs.0.557±0.163%，|t|= 2.396，P=0.024＜0.05)。图 1、2显示，右归丸可以显著降低 CAA患者外周血中的 Th17细胞表达。

图1 各组患者外周血中CD4 IL-17+T细胞百分率变化

图2 各组患者CD4 IL-17+T细胞百分率变化

2.3 右归丸能显著抑制 CAA患者血清中Th17细胞功能细胞因子的表达

图3～5显示，对不同治疗组患者血清中IL-6、IL-17、IL-23进行 ELISA检测结果显示，2组 CAA患者治疗前血清中 IL-6、IL-17、IL-23表达差异无统计学意义，但与健康对照组比较，观察组患者治疗前的 IL-6、IL-17、IL-23表达均明显增加(P＜0.01);经过右归丸治疗后观察组的 IL-6、IL-17、IL-23(P＜0.01)表达显著低于治疗前，也低于对照组治疗后(P＜0.01)。

图3 ELISA检测各组患者IL-17表达水平比较

2.4 右归丸降低 p-STAT3以及 RORγt水平上调SOCS3表达

图6表2显示，Western blot和Real-Time PCR结果均显示，CAA患者 p-STAT3以及 RORγ均较健康体检组表达升高，而SOCS3则表达趋势相反;结果显示，经右归丸作用后，观察组 p-STAT3与RORγt水平均下降，而 SOCS3表达较常规治疗明显上升，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图4 ELISA检测各组患者IL-6表达水平比较

图5 ELISA检测各组患者IL-23表达水平比较

图6 3组Western blot结果比较

3 讨论

通过文献［5-7］我们可知，肾阳虚是CAA的一个重要证型，故选取肾阳虚型 CAA的临床治疗方案及机制进行探讨。CAA属于中医学“虚劳”“血证”范畴，多种因素影响脏腑造血功能时均可发生再障。我们认为，精气内夺则积虚成损，积损成劳与肾关系密切，先天不足导致机体精血化生无源，而致CAA诸症，治疗可选用右归丸。本方由熟地黄、附子、肉桂、山药、山茱萸、菟丝子、鹿角胶、枸杞子、当归、杜仲组成，方中附子、肉桂、鹿角胶为君药，温补肾阳、填精补髓，臣药以熟地黄、枸杞子、山茱萸、山药滋肝肾之阴，佐以菟丝子阴阳双补;杜仲补益肝肾，强筋壮骨;当归补血养肝，诸药配合共奏温肾补阳、填精固髓之功。现代药理研究显示［8］，熟地黄、附子、肉桂可促进造血干细胞的增殖和分化;山药、枸杞子、山茱萸可延长体外脾细胞存活时间;鹿角胶能增加周围血液中的红细胞的数量。文献［9-10］也表明，右归丸作用于氢化可的松造成“阳虚”小鼠模型后，小鼠能 B淋巴细胞功能有明显改善和调节，溶血空斑数明显增加，小鼠的机体免疫功能有显著提高。

表2 RORγ基因变化比较(±s)

表2 RORγ基因变化比较(±s)

注:与健康体检组比较:*P＜0.05;与对照组治疗后比较:▲P＜0.05

组 别 时 间 CT(GAPDH) CT(GAPDH) 2-△△CT21.99±1.49 20.90±1.23 1对 照 组 治疗前 28.04±1.28 22.89±1.552.23±0.77*治疗后 23.11±1.32 21.77±1.981.24±0.48*观 察 组 治疗前 27.47±2.11 22.46±0.832.48±0.44*治疗后 26.01±1.02 21.98±1.831.98±0.51健康对照组＊▲

Th17细胞是近年发现的一种新的不同于Th1、Th2的CD4+T细胞亚群，因高分泌 IL-17而得名。IL-17属于促炎效应极强的因子，IL-17与受体结合后可以作用于多种细胞类型来诱导产生细胞因子，发挥着促进炎症发展、免疫应答等多种功能。本研究发现，CAA患者Th17细胞数目远高于正常健康对照组，这一结果与 deLatour［11］等在2010年发表的报道相吻合。经过治疗后，使用右归丸的患者虽然外周血 Th17细胞百分率仍高于健康体检组，但远较对照组降低(P＜0.05)。提示右归丸可以抑制 Th17细胞的异常活化，从而避免了机体自身反应性 T淋巴细胞功能亢进，减少对造血干祖细胞的破坏。

研究人员［12-13］证实，信号传导子和转录激活子3(STAT3)在CD4+T细胞向Th17细胞的分化过程中起重要作用，通过 STAT3的作用进而抑制Th17细胞的活化聚集。本研究分析 STAT3信号通路对CAA患者外周血中Th17细胞偏倚的作用，发现CAA患者磷酸化 STAT3水平较健康体检组高，而通路主要抑制因子SOCS3在CAA患者骨髓中表达明显低于健康体检组，由此认为是 STAT3信号通路的过度激活导致CAA患者初始 CD4+T细胞向Th17转化。另外我们发现，CAA患者体内IL-6、p-STAT3的水平明显高于健康对照组，说明IL-6浓度升高导致了 STAT3过度磷酸化，并在RORγt的作用下导致Th17的偏倚。经过治疗后，2组患者 IL-6、IL-17、IL-23、p-STAT3以及 RORγt水平均有明显下降(P＜0.01)，其中使用右归丸的患者发生变化的幅度更为明显 (P＜0.05)。提示在右归丸的干预下，STAT3蛋白因子发生磷酸化受抑制，由此导致细胞内核移位现象减弱，抑制了对下游相关基因的诱导，下调了 RORγt的表达，从而抑制初始 CD4+T细胞向 Th17的转化率。SOCS3是近年来新发现的STAT3信号通路抑制因子，研究结果显示CAA患者SOCS3蛋白水平明显低于空白对照组，治疗干预后2组患者SOCS3的表达均较治疗前上调，说明干预后可增强SOCS3抑制STAT3信号通路的能力以达到病情改善，而使用右归丸治疗的观察组患者SOCS3表达上调更加显著，表明右归丸抑制STAT3信号通路的作用更强，能进一步抑制初始 CD4+T细胞向Th17转化。

综上所述，我们认为STAT3信号通路过度激活导致Th17转化率增加，促进自身反应性T淋巴细胞功能亢进，使造血干祖细胞损伤从而出现CAA，右归丸通过抑制 STAT3信号通路磷酸化增强 SOCS3表达，从而达到部分逆转CAA的发展并改善其预后的目的。然而考虑结果受此次入选样本量较小、随访时间不长等因素影响，今后有待增加样本量，进一步研究以证实右归丸对于改善慢性再生障碍性贫血患者的确切机制及预后，为指导临床治疗提供参考价值。

［1］ Zheng M，Zheng K，Zhou J，et al.Tcf-1 gene silence suppresses downstream gene expression in CD4( + )T cells from bone marrow of aplastic anemia patients［J］.Ann Hematol，2012，91 (3):353-358.

［2］ 傅德杰，王智勇.以 Th17细胞为靶点治疗类风湿性关节炎研究进展［J］.免疫学杂志，2011，27(9):812-815.

［3］ Shen Y，Tang XY，Yang YC，et al.Impaired balance of Th17/ Treg in patients with nasal polyposis［J］.Scand J Immunol，2011，74(2):176-185.

［4］ 凡治国，张连生，柴哗，等.Thl7细胞水平的变化与急性髓系白血病发病关系的探讨［J］.中华血液学杂志，2010，31(9): 617-620.

［5］ 王西阁，王晓格，胡姬婷.CD4+CD25+CD127LOW调节性 T细胞及相关细胞因子在儿童再障发病中的作用［J］.山东医药，2010，50(13):10-12.

［6］ 施海涛，王金环，雍彦礼，等.补肾生血法治疗再生障碍性贫血300例疗效分析［J］.中医药信息，2010，27(2):53-55.

［7］ 粱正贤.刘娜，刘丽梅，等.补肾生血法对慢性再生障碍性贫血患者骨髓ERK信号通路相关蛋白表达的影响［J］.中医药信息，2010，27(5):59-61.

［8］ 陆惠，丁青.右归丸的现代药理新研究［J］.湖南中医药大学学报，2012，63(2):71-73.

［9］ 郑轶峰，姜建青，张力华，等.右归丸对骨髓抑制小鼠骨髓细胞周期和凋亡的影响［J］.西南军医，2009，11(3):395-397.

［10］ 姚建平，金国琴，戴薇薇，等.左归丸和右归丸对老年大鼠海马GRmRNA表达与HPA轴活性的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2009(10):67-69.

［11］ DeLatour R P，Visconte V，Takaku T，et al.Th17 immune responses contribute to the pathophysiology of aplastic anemia［J］.Blood，2010，116(20):4175-4184.

［12］ Knosp CA，Johnston JA.Regulation of CD4+T-cell polarization by suppressor of cytokine signalling proteins［J］.Immunology，2012，135(2):101-111.

［13］ 郭宁红，石庆之，华建媛，等.调节性 T细胞和 Thl7细胞比值的变化与特发性血小板减少性紫癜发病关系的研究［J］.中华血液学杂志，2010，31(9):610-612.

Observation of the Inhibition of Yougui Pills to Th17 Cells Activation in Patients with Chronic Aplastic Anemia of Kidney Yang Deficiency

GAO Feng1，GUAN Ju-mei1，2，AN Xue-mei2
(1.Sichaun College of Traditional Chinese Medicine 621000，China;2.Chengdu University of Chinese Medicine 610075，China;

To discuss the regulating function of Yougui Pills on Th17/Treg cell function peripheral blood of the patients with kidney-Yang deficiency type of Chronic Aplastic Anemia(CAA).Methods:Intervention were given to the two groups of patients with kidney-Yang deficiency type of CAA，the observation group took Yougui Pills on the basic treatment，and the other were set as the control group，both of the two groups has 30 days treatment，compared the two groups of patients before and after treatment with Th17 cell percentage，and the expression changes of p-STAT3，SOCS3，IL-6，IL-17，IL-23 and RORγt.Results:before the treatment，Th17 cell percentage，and the expression levels of SOCS3，IL-6，IL-17，IL-23，p-STAT3，and RORγt in the peripheral blood of the patients with CAA were much higher than the healthy control，and after the treatment，the indexes above of the observation group lower than the control group，the expression of SOCS3 were contrary to the trendency of the above indexes.Conclusion:Yougui pills plays an important role in the process in inhibiting inflammatory response which mediated by Th17 cells，it plays the role by the inhibition of STAT3 signal，provides therapeutic targets for autoimmune diseases.

Chronic aplastic anemia;Kidney-yang deficiency;Th17 cells;Flow cytometry detecting technology

R285.5

:B

:1006-3250(2016)04-0510-04

2015-06-27

国家自然科学基金资助项目(30973690)-基于肾阳虚体质研究少、长、壮、老肾阳盛衰的基因调控;教育部科学技术研究重点项目(211158)-右归丸干预老龄肾阳虚的甲基化调控机制

高 锋(1978-)，男，四川绵阳人，副教授，医学博士，从事脏腑病机及辨证规律与中医文献学研究。