肠道微生态与肝癌关系研究新进展

蒋建文，任志刚，郑树森

肠道微生态与肝癌关系研究新进展

蒋建文，任志刚，郑树森

由于肝脏与肠道紧密的解剖与功能关系，肠道微生物通过肝-肠循环和微生态-肝脏轴与宿主相互作用，在肝脏炎症、慢性纤维化及肿瘤发生发展中发挥重要作用。肠道微生态失衡促进肝癌进展，这是国际上实验动物肝癌发病机制的突破性进展。肠道微生物中关键功能菌可能成为肝癌诊治的新型生物标志物和治疗靶点。随着第二代高通量测序技术的发展，元基因组学研究从极大的深度和广度为我们认识肠道菌群与肝癌的关系开辟了新的途径。

肠道微生态；肝脏肿瘤；元基因组学；炎-癌转变；整合肝肠病学

肝癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，发病率居所有肿瘤的第7位，病死率为第3位［1］。我国HCC大多数与HBV感染相关，HCC发病隐匿，就诊时多是中晚期，疗效很差。目前国内外HCC发生发展的机制研究主要集中在肝炎病毒、化学毒物及代谢物等致病因子引起的肝细胞基因突变、肿瘤干细胞及炎-癌转变的分子机制等方面。近期研究证明肠道微生态变化对慢性肝脏病变进展有重要影响［2］，但肠道菌群是否参与HCC的发生发展尚不清楚，本文就该方向的研究综述如下。

1 肠道微生态及其与慢性肝病的关系

人体肠道内定植着数目庞大、结构复杂的微生物群落。肠道菌群与机体存在共生关系，是人体最为重要的微生态系统，Eckburg［3］提出肠道菌群相当于人体的一个重要代谢“器官”。肠道菌群和宿主共生并共进化过程中，从营养、代谢及免疫等诸多方面影响人体健康，肠道微生态失衡与人体多种疾病如感染性疾病、肥胖症、糖尿病、肝病、冠心病以及肿瘤等存在密切关系［4-5］。

在人体内，肝脏与肠道微生态相互协调，相互影响。肠道微生物通过肝-肠循环和微生态-肝脏轴，与宿主相互作用，在肝脏炎症、慢性纤维化及肝硬化发生发展中发挥重要作用［2］。Lin等［6］的研究证实在伴刀豆球蛋白A诱导的大鼠急性肝炎过程中，破坏肠道微生态可加强脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）与肝脏Kuffer细胞上的Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）结合，进而启动后续炎症信号通路，加重肝炎病变，而应用抗生素抑制肠道菌群能减轻肝脏炎症损伤。Chen等［7］发现肝硬化患者肠道菌群结构与正常对照存在显著差异，且肠道微生态失衡程度与肝硬化病情严重程度呈显著正相关，毛螺菌、双歧杆菌等益生菌在肝硬化患者中明显减少，而肠杆菌、链球菌等潜在致病菌则明显增加。

2 动物实验研究证实肠道微生态失衡参与HCC进展

王红阳团队、Dapito和Darnaud 等在动物实验层面证实肠道微生态失衡促进HCC进展［8-11］，这是国际上实验动物HCC发病机制的突破性进展。2010年王红阳团队的Yu等［8］第一次发表肠道内毒素促进HCC发生的研究，他们发现二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine， DEN）诱导的HCC小鼠模型LPS水平上升，并明确骨髓来源的肝脏Kuffer细胞是LPS的作用靶点，Kuffer细胞产生促炎调节因子TNF-α与IL-6，通过LPS-TLR4信号通路产生了旁分泌活化的促肿瘤细胞因子，激活了癌前肝细胞增殖。证明在DEN诱导的早期肝损害过程中，通过移植TLR4-/-小鼠的骨髓，抑制了Kuffer细胞膜上的TLR4活化，进而明显减轻DEN诱导的炎症反应导致的肝脏病变；采用TLR4-/-小鼠进行实验，炎症细胞因子的产生与随后的肿瘤形成明显减少。

2012年王红阳团队的Zhang等［9］发现使用益生菌可改善肠道微环境，减少肠道炎症，同时减少肝脏肿瘤的生长与增殖。益生菌不仅可以抑制LPS等病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns， PAMPs）由肠道易位至肝脏，还可激活损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns， DAMPs），如高迁移率族蛋白1（high mobility group box1， HMGB1），使促炎与抗炎细胞因子减少，继而减缓了肝脏中的肿瘤相关性炎症。他们发现破坏肠道稳态会促进HCC的进展，通过益生菌改善肠道稳态能够减缓HCC的进展。

同年Dapito等［10］发现肠道菌群通过肝星状细胞上的TLR4增加肝脏有丝分裂原免疫调节的表达和阻碍凋亡而促进了DEN诱导的HCC的进展，且通过实验证实非骨髓来源的肝星状细胞膜上的TLR4介导产生炎症信号对慢性炎症导致的HCC有促进作用。非骨髓来源的肝星状细胞与肝细胞是LPS的主要作用靶点，肝星状细胞的TLR4介导损伤后的再生反馈导致肝脏细胞代偿性增殖，肝细胞的TLR4阻止了肝脏细胞与前恶性细胞的凋亡，而肠道的无菌状态可有效抑制HCC的发展，明显减小HCC体积。这表明肠道菌群可作为肝脏疾病向HCC进展的治疗靶标。随后Darnaud等［11］提出了靶向肠道微生态治疗可能阻止HCC的进展的科学设想。

2013年Yoshimoto等［12］报道在肥胖相关的HCC小鼠模型中，肠道菌群变化使脱氧胆酸（deoxycholic acid， DCA）水平增加，DCA是肠道菌群代谢胆汁酸的产物，已知DCA会造成肝细胞DNA损伤引发HCC的发生，同时肠道菌群变化引起肝星状细胞中出现衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype， SASP），引起多种炎症和肿瘤因子分泌，导致小鼠发生HCC。去除衰老的肝星状细胞或SASP诱导因子缺失可降低HCC发生率。

3 肠道微生态失衡参与HBV相关性HCC（HBV-related HCC， HBV-HCC）进展的假说

流行病学调查亦提示肠道微生态失衡和HCC具有内在联系。多项研究显示糖尿病和肥胖患者肠道微生态均出现不同程度的失衡［13-14］。Welzel等［15］通过流行病学调查显示，在美国糖尿病和肥胖已成为大规模人群发生HCC的最大危险因素，在总数上已经超过肝炎等病因导致的HCC。上述结论可供HBV-HCC发生和发展的研究借鉴。

HBV是HBV-HCC 的重要原因，但是HBV本身并不具有细胞致病能力，其引起的肝脏炎性损伤一般被认为是宿主的免疫系统针对HBV 抗原的免疫反应，HBV 的DNA 能够整合进肝细胞的DNA中，容易产生免疫逃逸，引发持续的免疫反应，导致慢性肝炎，进而进展为肝硬化。肝硬化可导致肝功能异常，肠道静脉淤血和渗出增加，肠道正常菌群组成和比例发生变化，肠道菌群可通过产生内毒素和其他代谢物进一步加重对肝脏的损伤［16］。从整合肝肠病学的观点看，HBV通过机体免疫系统引起的慢性乙型肝炎及肝硬化，对肠道微生态产生负面影响，肠道微生态存在着慢性失衡，进而通过免疫、代谢及营养等多途径影响炎性或者硬化状态的肝脏，失衡的肠道菌群可能作为HBV 致癌的协同因素即通过“肝-肠轴”促进肝细胞癌变的局部微环境的形成，进而促进HCC的进展。这就是本文作者蒋建文提出的假说——肠道微生态失衡参与乙型肝炎相关性HCC的进展。

4 肠道微生物中关键功能菌可能成为HCC的新型生物标志物和治疗靶标

在HCC的诊断和治疗中，寻找精准的生物标志物和治疗靶点至关重要。肠道未知微生物极多，其关键菌群可能具有重要的研究前景。Lu等［17］发现肠道中双歧杆菌与肠杆菌比值（B/E值，B/E）在肝病发展中可用于跟踪肠道微生态失调的水平。Zhu等［18］发现非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steato hepatitis， NASH）患者肠道中产酒精细菌比例上升，导致血液中内源性乙醇浓度升高，提示产酒精细菌参与NASH发病，可能作为干预靶点或疾病标记物。Arumugam等［19］应用肠道菌群的宏基因组测序技术分析发现，人类肠道微生物包含300万个基因，是人类基因的150倍，同时发现人类肠道内包括3类不同的细菌生态系统，称之为“肠型”，包括bacteroides（肠型1）、prevotella（肠型2）和ruminococcus（肠型3）3种类型。“肠型”结构与功能是相符的，提示肠道菌群标志物具有潜在的诊断作用，肠道菌群“肠型”构成可以反映人群的疾病易感性。

2013年11月22日，Science连续发表3篇关于肠道微生态与肿瘤治疗反应的文章。其中，Iida 等［20］发现肠道共生菌通过调节肿瘤微环境来控制肿瘤对于治疗的反应，Pennisi［21］指出肠道共生菌有助于癌症的治疗，Viaud 等［22］指出肠道微生态调节环磷酰胺的抗肿瘤免疫作用。这一发现表明肠道微生态有助于机体形成抗肿瘤的免疫反应。2016 年2 月Li 等［23］报道新型益生菌组合prohep可以有效抑制小鼠的肝脏肿瘤生长。这组益生菌的抗癌功能可能与促进抗炎IL-10 细胞因子的分泌和抑制促炎细胞Th17 细胞的分化和IL-17细胞因子的分泌有关。因此，靶向肠道微生物标记物可能是HCC诊断的有力工具，通过对靶向微生物进行调节可以成为治疗HCC的新的靶标。

5 第二代高通量测序技术为认识肠道菌群和HCC的关系开辟了新的途径

肠道菌群复杂多样，绝大多数厌氧生长，大多数细菌目前条件下无法培养。元基因组学是指通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA，构建元基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。第二代高通量测序技术为深入研究人类肠道微生态的元基因组提供了快速、准确及可行的方法。Illumina公司推出的HiSeq高通量测序系统，以其革命性的流程和无可比拟的准确性，成为国际上最先进和实用的快速高效的测序平台，适合进行肠道菌群元基因组研究。

2010年3月，欧洲人体肠道微生物基因组（metagenomics of the human intestinal tract， MetaHIT）联盟研究人员报道，该组织运用Illumina高通量测序技术完成了对124名欧洲个体的肠道菌群样本的元基因组学分析，产生了576.7 Gb的数据量，完成了3 300 000微生物基因的序列组装拼接和功能注释［24］。2012年，Qin等［25］报道他们在糖尿病患者的研究中也证实了Hiseq高通量测序系统用于肠道元基因组研究的可靠性和科学性，并且构建了中国人群糖尿病患者的肠道菌群元基因数据集。2013年Karlsson等［26］报道他们比较了145位患有Ⅱ型糖尿病、葡萄糖耐量降低和正常女性的肠道菌群元基因组，开发出一种基于元基因组分析的肠道菌群模型，该模型能够区分Ⅱ型糖尿患者和健康人，比目前常用的身体质量指数和腰臀围比例等指标更具有预测价值。2014年秦楠等［27］报道，利用HiSeq2000高通量测序平台解析了中国肝硬化患者的肠道微生态元基因组变化，构建的基因集中有75 245个基因在肝硬化患者和健康志愿者中呈显著差异，并创建了由15个特异性的肠道菌群标记物构成的具有高准确度的肝硬化患者区分指数，在独立样本中得到验证。这些生物标志物对于肝硬化的诊断和治疗具有重要意义。

肝癌严重的危害我国人民的健康， 2015年中国HCC的发病率居所有肿瘤的第4位（约46.6万例），死亡率居第3位（约42万例）［28］。HCC的发生是一个较为漫长的过程，通常经过肝炎、肝硬化、HCC的病理进展过程。从肠道微生态角度研究其与HCC的发生发展关系，并从肠道微生态角度探索HCC的辅助治疗方法具有明显的创新性和重要意义。

6 展 望

肠道微生态基础和应用基础研究已经得到各国的广泛重视。随着第二代高通量测序技术的发展，元基因组学研究从极大的深度和广度为人类认识肠道菌群和疾病的关系开辟了新的途径。从肠道微生物与肝脏的相互作用方面探索HCC新的促发原因和形成机制，对我国HBV-HCC的发病机制研究，预防和治疗都将有着重要的意义。

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（2016-09-01收稿 2016-10-07修回）

（责任编委 李 军 本文编辑 赵雅琳）

The Cutting Edge of Research Advance on the relationship between intestinal microecology and hepatocellular carcinoma

JIANG Jian-wen， REN Zhi-gang， ZHENG Shu-sen*
Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery， First Affiliated Hospital， School of Medicine， Zhejiang University； Key Laboratory of Combined Multi-organ Transplantation， Ministry of Public Health， Hangzhou， Zhejiang 310003， China

， E-mail: shusenzheng@zju.edu.cn

Due to the close anatomical and functional relationship between the liver and the intestine， intestinal microflora，interact with liver function through the liver-intestinal axis. It plays an important role in the development of the liver inflammation，fibrosis and tumor. Intestinal microflora disorders promote the progress of hepatocellular carcinoma （HCC）， which is an international breakthrough in the pathogenesis of HCC in experimental animals. Key feature strains of the intestinal microflora may become new biomarkers and therapeutic targets of HCC. With the development of the second generation high throughput sequencing technology， the research of metagenomics has opened up a new way for us to understand the relationship between intestinal microflora and HCC from the great depth and breadth.

intestinal microecology； hepatocellular carcinoma； metagenomics； inflammation-carcinoma shift； holistic integrative hepato-enterology

R37； R735.7

A

1007-8134（2016）05-0264-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2016.05.002

浙江省医药卫生科学研究基金（2014KYB081）；浙江省自然科学基金（LY15H160033）；传染病诊治国家重点实验室开放基金（2015KF03）；国家自然科学基金（81672422）；国家重点基础研究发展计划（2013CB531403）

310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科 卫生部多器官联合移植重点实验室（蒋建文、 任志刚 、郑树森）；感染性疾病诊治协同创新中心（蒋建文、郑树森）；国际保健中心（蒋建文）；450002，郑州大学第一附属医院感染科（任志刚）

郑树森，E-mail: shusenzheng@zju.edu.cn