γ射线和紫外线应用于血液制剂中病原体和白细胞的灭活

周炜鑫，郭天虹 综述，黄远帅 审校

(西南医科大学附属医院输血科,四川泸州 646000)



·综 述· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.28.042

γ射线和紫外线应用于血液制剂中病原体和白细胞的灭活

周炜鑫，郭天虹 综述，黄远帅△审校

(西南医科大学附属医院输血科,四川泸州 646000)

γ射线；紫外线；白细胞；血传病原体；灭活

据2015年世界卫生组织(World Health Organization,WHO)报道，全球每年采集的献血量约为1.08亿单位。通常，从献血员的全血中可以分离出红细胞、血小板和血浆等成分。红细胞可以用于大量失血的患者，挽救其生命；血小板可以用于各种原因引起的血小板减少的患者；血浆里的凝血因子和血浆衍生蛋白质可以用作血友病和先天免疫缺陷患者的替代治疗；血浆里提取出来的免疫球蛋白通过静脉或者肌肉注射，适用于免疫缺陷综合征患者、药物或者免疫抑制引起的免疫功能失调、免疫紊乱导致的血液疾病及炎性反应，此外，还可以提供被动免疫及有效调节免疫缺陷患者的免疫应答，是现在广泛使用的生物制剂。由此可见，现代医学中，血液制剂的输注与患者息息相关，是不可或缺的支持疗法。本文就输血安全以及γ射线和紫外线在提高血液制剂安全性上的应用进行综述。

1 输注血液制剂可能会引起的不良后果

伴随着输血而来的弊端在于输血除了会引起发热、过敏等不良输血反应，还可能会引起疾病的传播。有报道称，患者在使用了血浆衍生物-纤维蛋白粘合剂后感染了人类微小病毒B19[1]。而且血液本身的一些成分也会引起一些不良后果，例如当受血者输注了含有残留的献血员白细胞的血液制剂后，会引起免疫相关的严重后果，包括非溶血性的发热反应、人类白细胞抗原(HLA)同种异体免疫反应、输血相关的移植物抗宿主疾病(transfusion-associated graft-versus-host disease,TA-GVHD)等[2]。血小板相关的细胞因子和白细胞相关的炎性因子IL-6、IL-8和TNF等则会引起非溶血性发热反应和过敏反应。而血小板相关的细胞因子是主要原因，因为在用白细胞滤过器去除白细胞后，可以减少非溶血性发热反应的发生但并不能消除，而过敏反应却无变化[3]。因此，血液制剂的安全一直受到医务人员和患者的高度重视。

随着监管力量的日益增强以及不断出现的先进的筛选技术，大大降低了输血引起的疾病传播，比如病原体减少技术(pathogen reduction technology，PRT)可以减少输血引起的疾病传播，提高血液安全性，同时保证血液制剂结构和功能的完整性[4]。然而，尽管病毒检测技术的不断提高，仍然不能避免输血引起的窗口期疾病传播，故输血仍然存在风险。对于会引起不良后果的白细胞，有研究表明，25 Gy的γ辐照足以阻止T淋巴细胞的增殖，可以预防免疫功能低下的患者发生TA-GVHD[5]；白细胞滤过减少器处理的血液制剂要求每个输注单位残余的白细胞数低于5×106(美国)和 1×106(欧盟)，这2种方法处理血液制剂都可以减少但不能消除以上白细胞引起的相关不良免疫反应。故为了能进一步提高血液制剂的安全性，需要更多更有效的方法应用于去除血液制剂中的包括病原体、白细胞等给受血者带来不良反应的物质。

2 需要保障血液制剂的安全性

能够提高血液制剂安全性的理想方法应该具备以下特点[6]：(1)可以灭活所有有包膜和无包膜的病毒；(2)对产品的生物活性无不良反应，最小程度地减少生物制剂的成分丢失；(3)在适宜的条件下稳定可靠，适用于大批量血浆制剂的流水线灭活；(4)不能添加一些后续步骤中必须去除的物质；(5)应当经济安全，可以广泛应用；(6)灭活步骤最好能够在血液制剂保存的最终容器里进行；(7)该方法对产品没有毒理学作用。目前，常用于灭活病原体和白细胞的方法有γ射线辐照、紫外线照射、白细胞滤过器过滤、碘液灭菌等，在灭活病原体或者白细胞上各有优缺点。碘酒可用于灭活几乎所有类型的病原微生物，包括细菌、病毒、寄生虫等，是一种运用至今的消毒灭菌方法，可灭活血清、血浆或者血浆蛋白中有包膜和无包膜的病毒。但目前应用最广泛的是γ射线和紫外线照射。

2.1 γ射线辐照对病原体和血液成分的影响 γ射线是一种电磁波，是原子核能级跃迁蜕变时释放出的射线，因此很小的剂量能通过相互作用拥有强大的穿透力。γ射线可以通过二次反应产生自由基和活性氧来最大限度地灭活病原体。近半个世纪以前，就有学者报道γ射线能通过电离作用消除病原体核酸的活性和传染性[7]；肖洁等[8]研究报道20～40 Gy的137Csγ射线能够有效灭活单采血小板里的铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和表皮葡萄球菌而不影响血小板的质量；Miekka 等[6]报道称，45 Gy的γ射线的剂量几乎可以灭活所有包括无包膜病毒在内的血源性传播病毒。γ射线灭活病毒主要与剂量，病毒核酸大小及病毒的种类相关[9]。通常γ射线灭活细菌需要的剂量是20～25 Gy，而灭活病毒的剂量更大。尽管病毒的核酸大小远远小于细菌，但灭活病原体所需的γ射线的剂量与病原体的核酸体积大小成反比。因此，γ射线辐照常用于医疗设备、药品、食品、培养专用血清等的消毒灭菌。与此同时，γ射线还能够降低白细胞的活性，γ射线辐照处理血液制剂灭活白细胞来预防TA-GVHD已经有40年[10]。

然而商业性的治疗型生物制剂并未把γ射线辐照作为灭活病毒的常用方法，因为45～50 Gy的剂量在灭活病毒的同时也可能会破坏生物制剂的活性，比如血浆相关蛋白等。有研究表明γ射线破坏蛋白质有2个机制：(1)可以直接作用于目标蛋白的共价键，通过光子聚集的能量来破坏这个蛋白分子；(2)间接与水分子作用产生自由基和活性氧来破坏99.9%的蛋白质[11]。间接作用包括：在有氧条件下，γ射线作用于水溶液会产生水合电子、氢原子、过氧化氢及最具杀伤力的羟基自由基等，均可导致蛋白质发生物理和化学方面的改变，比如蛋白质侧链氧化、蛋白链分离和破碎、交联、解链、形成新的反应基团，包括疏水性氨基、酰基残基氧化形成的羟基和过氧化氢衍生物，蛋白质羧基化产物，二聚酪氨酸等许多新的基团。这一系列反应破坏了蛋白质的完整性，导致蛋白质丧失了生物活性[12]。

尽管理论上如此，但在实践过程中有学者发现，在某些条件下，杀病毒剂量的γ射线并没有对相关蛋白产生明显的影响。在Tran 等[13]的研究中，对于用杀病毒剂量(45 Gy)的γ射线辐照静脉注射的免疫球蛋白(intravenous immunoglobulins，IVIG)后，发现其Fab和Fc段的结构域保持辐照前的完整性，故推荐使用γ射线来处理IVIG提高其安全性。Smeltzer 等[14]用不同剂量γ射线对IgG进行照射，通过SDS-PAGE、HPLC、ELISA等方法来检测IgG的抗原结合能力和Fc段结合能力，以此来探究γ射线对IgG结构和功能的影响。结果显示，在-80 ℃时，杀病毒剂量50 Gy 射线的照射下，免疫球蛋白多肽链的完整性和二级结构不被破坏，三级结构构象发生了变化但不足以影响免疫球蛋白功能活性，并且对最重要的结构区域的构象完整性无影响，因为对比辐照和未辐照的IVIG的熵值大小接近，故证明在辐照下蛋白质并未发生明显的内部反应。所以，尽管γ射线对蛋白质分子的热稳定性产生了轻微的影响，但是并没有改变IgG的本质。进一步研究还发现，γ射线对IgG完整性的影响小于pH的变化对IgG完整性的影响。Grieb 等[15]研究发现，porcine parvo-virus(PPV)是最耐受γ辐照的无包膜病毒，用45 Gy的剂量辐照混入PPV病毒的单克隆抗体，当抗坏血酸钠和自由基清除剂加入后或者将单克隆抗体冻干后辐照，都可以使PPV数量减少1×105个，并且保护单克隆抗体的功能活性和主要结构的完整性。当剂量增加至50 Gy时，可以灭活1×1010个的PPV，而单克隆抗体跟抗原结合的活性可以得到超出97%的恢复。因此，他们认为，在杀病毒剂量的γ辐照过程中，加入抗氧化剂或者自由基清除剂，或者在冰冻固体状态下辐照可以很好地保护生物制剂有效成分的活性。

除了对血浆蛋白的影响，γ射线对红细胞和凝血因子等也有一定的影响。γ射线会改变红细胞的形态、电解质浓度等。Xu 等[16]研究了不同剂量的γ射线对红细胞超微结构的影响，以及辐照后红细胞储存不同时间下的电解质和pH的变化。结果显示随着剂量的增加，出现异常形态红细胞(棘形红细胞，退化红细胞等)的比例逐渐增加；辐照对Na+、K+、Cl-水平有影响，且对K+的影响最大，因为辐照可能会改变细胞的渗透压和膜通透性，随着剂量增大，电解质水平改变更加明显。而pH的下降与γ射线剂量和红细胞储存时间相关。Sarkar 等[17]研究了γ射线与凝血因子之间的联系，他们用30 Gy剂量的γ射线辐照新鲜冰冻血浆后，通过检测PT、APTT、TT、vWFAg、FⅡ、FV、FⅧ、FIX、FX、FXI、FⅫ、C蛋白、S蛋白、D-二聚体等的变化，探讨γ射线对新鲜冰冻血浆凝血和抗凝功能的影响。结果显示，30 Gy的γ射线辐照后，缩短了PT、APTT、TT，激活了FIX、FX、FXI、FXII。但是这些变化都很微小，无重要的临床意义。而对抗凝系统(C蛋白、S蛋白活性)和纤溶系统也无影响。该研究结果与Weisbach 等[18]的研究相符。由此可见，γ射线可以用于血浆及其血浆衍生蛋白制品和红细胞制剂的病原体和残留白细胞的灭活。

2.2 紫外线照射对病原体和血液成分的影响 近年来，有学者提倡用紫外线来替代γ射线。因为与光化学、光动力学灭菌法相比较，紫外线具有明显的优势，它本身具有活性，不需要加入可能会封闭蛋白质以致产生有害免疫反应[19]的光敏化合物，因此，也不需要去除光敏化合物及它的代谢产物。一般来讲，最常使用的是短波(UVB，200～280 nm)和中波紫外线(UVB,200～280 nm)。UVC和UVB灭活病原体的原理在于，可以作用于病毒的核苷酸使之形成环丁烷嘧啶和嘧啶二聚体，从而阻止病毒核酸的复制延长，达到灭活病毒的作用[20]。Mohr 等[21]研究结果表明，通过比较1 J/cm2UVC和2 J/cm2的UVB照射对血浆功能的影响，得出UVC更加适合血浆的灭菌；DNA病毒比RNA病毒、单链核酸病毒比双链核酸病毒对紫外线敏感。用1 J/cm2UVC照射含病毒[水疱性口炎病毒(VSV)、单纯疱疹病毒(SHV-1)、脑心肌炎病毒(EMCV)、猪细小病毒(PPV)和艾滋病病毒(HIV)等]的血浆后，除HIV以外，所有病毒都被灭活了，同时凝血因子和血浆蛋白的损失不超过10%～20%。Fast 等[10]报道称，核黄素(维生素B2)联合紫外线辐照可以通过不可逆地改变核酸，来灭活大部分的病原体及抑制由白细胞引起的一系列诸如移植物抗宿主反应，同种异体免疫等有害的免疫反应。此外，核黄素(维生素B2)联合紫外线辐照还可以减少有包膜和无包膜的病毒，以及与临床相关的污染菌[4]。重要的是，这种方法处理新鲜冰冻血浆后对蛋白质和凝血因子Ⅷ的活性无影响[22]。因此，紫外线照射可以用于血液制剂的病原体灭活。

2.3 γ射线辐照和紫外线照射对白细胞功能的影响 此外，γ射线和紫外线都可以作用于白细胞，减低它的活性，有学者对比研究了这两种方法对白细胞的不同影响。Fast 等[10]研究了全血用核黄素(维生素B2)联合紫外线和单独用γ射线分别处理后，通过体内和体外实验来对比2种方法对白细胞活性和功能的影响。体外实验表明，核黄素(维生素B2)联合紫外线照射可以抑制同种免疫反应及让白细胞失去抗原提呈的能力；相反，γ射线辐照不具有此作用。2种方法都可以阻止淋巴细胞的增殖。γ射线辐照后分泌的细胞因子浓度(TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1β、IL-8)与未作处理组比较并未发现明显差异，而核黄素(维生素B2)联合紫外线处理后，可以影响细胞因子的合成从而使大部分的细胞因子(除TNF-α、IL-8外)分泌减少。体内实验包括从核黄素(维生素B2)联合紫外线、γ射线(25 Gy)处理的血液和不作处理的血液中分离出白细胞注射到小鼠体内，观察他们发生GVHD的发展情况，结果这2种方法处理过的白细胞输注后都未引起小鼠的GVHD。因此，他们推荐用核黄素(维生素B2)联合紫外线照射来替代γ射线辐照处理血液来提高成本效益。Reddy等[23]作了一个体内体外实验，结果表明，核黄素(维生素B2)紫外线照射与γ辐照(25 Gy)相比，对于灭活白细胞预防GVHD的能力是相同的，但更加有效地减少细胞因子生成和同种免疫反应，该结果与Fast 等[10]的实验结果相符。最近，Pohler 等[2]的研究也证实了γ射线辐照和紫外线这两种方法对于预防GVHD具有同样的效果，而在抑制T细胞增殖、细胞因子分泌和抗原提呈能力方面，紫外线优于γ射线辐照。因此紫外线照射作为替代γ射线辐照的一种方法，应用于灭活血液制剂中残留的白细胞来预防GVHD。

3 展 望

由此可见，γ射线和紫外线灭活病原体和白细胞的机制和影响都有不同之处。γ射线杀病原体有直接和间接作用，直接作用是射线与核酸的相互作用，导致核酸链的交联和断裂。间接作用是与细胞内外的环境，如与水发生作用产生自由基、羟自由基和氢原子等[24]。紫外线(254 nm)可以直接作用于核酸，导致嘧啶二聚体的产生，从而阻止核酸转录的延长。当加入核黄素后，在紫外光照射下，可以特异性地在核酸的鸟嘌呤碱基处对DNA造成损伤，从而使核酸骨架链断裂，灭活病原体[25]。γ射线和紫外线都可以灭活白细胞预防GVHD，但在抑制T细胞增殖、细胞因子分泌和抗原提呈能力方面，紫外线优于γ射线辐照。不足之处在于，两种方法处理血液制剂可能会破坏生物制剂的有效成分。γ射线与水分子作用产生自由基和活性氧破坏蛋白质，紫外线通过氧化芳香族氨基酸，打开肽链之间的二硫键来破坏蛋白质的结构。但对于γ射线，加入抗氧化剂或自由基清除剂，或者在冰冻固体状态下辐照可以很好地保护生物制剂的有效成分活性。总之，临床工作中，应当根据不同目的来选取不同的方法，同时不断创新改进现有方法，尽可能地保证血液制剂的质量。

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四川省卫生厅科研基金资助项目(120336)；西南医科大学附属医院自然科学基金项目(15048)。 作者简介:周炜鑫(1990-)， 在读硕士，主要从事自体输血、输血安全研究。△

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