针刺对脑缺血再灌注大鼠皮质缺血半暗带细胞超微结构的影响

许军峰 张　浪，田　骞，郭士明，郑亚玲，汪晓晴

(1.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193;2.中国中医科学院博士后科研流动站,北京 100700；3.子长县人民医院，陕西 子长 717300;4.天津市东丽区中医院，天津 300300;5.天津中医药大学，天津 300193)

针刺对脑缺血再灌注大鼠皮质缺血半暗带细胞超微结构的影响

许军峰1,2张浪3，田骞1，郭士明4，郑亚玲5，汪晓晴5

(1.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193;2.中国中医科学院博士后科研流动站,北京 100700；3.子长县人民医院，陕西 子长 717300;4.天津市东丽区中医院，天津 300300;5.天津中医药大学，天津 300193)

摘要：目的观察脑缺血再灌注后,针刺对脑缺血再灌注大鼠皮质缺血半暗带细胞超微结构的影响。方法采用改良Longa氏线栓法制作局灶性脑缺血再灌注大鼠模型，用多聚甲醛灌注，戊而醛固定，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色后,HU-12A 型电镜下观察大鼠皮质缺血半暗带细胞超微结构的变化。结果模型组6 h神经元轻度损伤，染色质边集凝固，血管周围水肿，水肿渗出明显，毛细血管管腔狭窄，脑组织散在水肿，脑细胞破坏；针刺组5 d后神经元结构正常，血管通畅，毛细血管内皮细胞无损伤，脑组织无水肿、渗出、无坏死区域，新生毛细血管增多。结论针刺能够减轻脑水肿，较少神经元细胞的损伤，促进新生毛细血管的增生，从而达到保护脑组织的目的。

关键词：针灸疗法；脑缺血再灌注；细胞超微结构

在世界范围内，脑卒中是死因排第二位的疾病，同时也是致残的主要原因。随着人口的老龄化[1]，脑梗死的发病率还在不断地攀升。而缺血性卒中(脑梗死)约占脑卒中的80%[2-3]，目前被证明有效的药物仅有溶栓药和抗血小板剂[4]。溶栓治疗是目前最有效的治疗手段，但溶栓治疗的适应症非常严格而且具有潜在的风险(如颅内出血)导致仅有极少数病人能接受溶栓治疗。针刺治疗脑卒中疗效显著，本文将从脑缺血再灌注大鼠皮质缺血半暗带细胞超微结构方面研究针刺的作用。

1材料与方法

1.1动物SPF级健康成年雄性SD大鼠46只，体质量280～300g，由中国医学科学院实验动物中心提供。

1.2分组与取材选择清洁级健康成年雄性的SD 大鼠36只，体质量280～330 g，按随机数字表法分为模型组(即手术组)、假手术组和针刺组，每组12 只。手术组和针刺组按再灌注时间点和脑组织取材来源再分为：6 h缺血侧(I 1)、6 h缺血对侧(C 1)、5 d缺血侧(I 2)、5 d缺血对侧(C 2)4个亚组。I 1 和I 2在梗死灶边缘区顶叶皮层取材，C 1和C 2则在大脑对侧相应皮层取材。相同再灌注时间点的缺血侧与缺血对侧的脑组织取材于同一大鼠，6 h和5 d各5 只。假手术组再分为6 h(S 1)和5 d(S 2)2个亚组，各5只，取材部位与I 1、I 2一致。

1.3大鼠脑缺血再灌注模型的建立参照改良Longa氏线栓法[5]制备右侧大脑中动脉闭塞模型，在阻塞大脑中动脉90 min 时将栓线拔出至颈外动脉内实现再灌注。大鼠清醒后出现左上肢瘫痪、转圈、追尾征等为成功模型。假手术组不插入线栓，其余操作同手术组。术中及大鼠苏醒过程肛温保持在37 ℃。

1.4醒脑开窍取穴及针刺方法根据中国针灸学会实验针灸研究会制定的“动物针灸穴位图谱”，选用人中、内关、三阴交共3个穴位进行针刺，非穴点取胁下固定点作为对照，针具用苏州医疗用品厂生产的“华佗牌”毫针，长1.5寸，直径0.32 mm。先刺双侧内关：直刺0.5～1寸，用捻转提插结合泻法，施手法1 min；继刺人中：向鼻中隔方向斜刺0.3～0.5寸，用重雀啄法，施手法1 min；再刺三阴交：沿胫骨内侧缘与皮肤呈45°角斜刺，进针1～1.5寸，用提插补法，使患侧下肢抽动3次为度。非穴点进针0.5～1寸，施平补平泻手法1 min。6 h组针刺1次，5 d组针刺3 d。

1.5主要试剂醋酸铀和枸橼酸铅、树脂、多聚甲醛、输液瓶及输液管、戊而醛、锇酸、乙醇和环氧丙烷、醋酸铀、环氧丙烷、EPON包埋液等。

1.6主要步骤麻醉行脑灌注固定,分离皮质、海马,固定、脱水、树脂包埋、超薄切片、醋酸铀和枸橼酸铅双重染色后,HU- 12A 型电镜下观察并摄片。1)灌注:麻醉后开胸，暴露充分些容易心脏穿刺及剪开右心耳。心尖插入灌注针头，剪开右心耳，开放静脉血。先灌注生理盐水约100 mL，见到老鼠两前肢及两肺变白可改灌注多聚甲醛。灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动(下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全)，前肢及颈部僵硬，所灌注的脑组织白而硬。2)取脑:剪开皮肤暴露头及颈段，从颈椎处剪断颈髓，分离除去后颈部肌肉，用弯钳仔细剔除颅骨，分离颅骨时注意硬脑膜，避免硬脑膜划伤脑组织。取脑时可以从延髓开始，慢慢分离颅底组织。取脑缺血灶边缘区皮质组织1 m3，用6%的戊而醛固定剂2 h。3)切片：固定的组织以0.1 mol的PBS洗2遍，加入1%锇酸固定1 h，以蒸馏水将标本洗2遍，继之以30%、70%、90%、100%乙醇和环氧丙烷各脱水10～15 min，用1∶1环氧丙烷和EPON包埋液的混合液浸透标本2 h后加入包埋液浸透，将标本挑入胶囊中放入烤箱(60 ℃，24 h)。用德国LKB8870超薄切片机切片，厚度 500 nm，醋酸铀染液染10 min，铅染液染8 min，用HU-12A电子显微镜观察。

2结果

电镜下可见脑皮质缺血灶周围皮质部分假手术组6 h组神经元胶质细胞结构正常，无炎性细胞侵润，无水肿坏死，线粒体机构正常；模型组6 h神经元轻度损伤，染色质边集凝固，血管周围水肿，水肿渗出明显，毛细血管管腔狭窄，脑组织散在水肿，脑细胞破坏；针刺组6 h胶质细胞轻度损伤，髓鞘退行性变，大部分毛细血管接近正常，偶见角质细胞凋亡，大部分神经元细胞结构正常，少数水肿。假手术组5 d神经元、胶质细胞、毛细血管、血管内皮细胞结构正常，脑组织无水肿或渗出；模型组5 d部分脑组织局灶性坏死，周围水肿，血管内皮损伤不明显；针刺组5 d神经元结构正常，血管通畅，毛细血管内皮细胞无损伤，脑组织无水肿、渗出、无坏死区域，新生毛细血管增多。

3小结

JIANG Bin[6]、杨文娟[7]指出我国的脑梗死及脑出血发病率高于西方国家，尤其是≥55岁的个体。MICHAEL HLEV等[8]研究表明，急性期应予以溶栓治疗为主，对于没有溶栓使血管完全再通的患者，病灶具有进一步扩大的趋势。HAROLD P[9]研、梁磊[10]究报告也指出目前治疗方法主要包括动脉内溶栓，加强脑灌注，搭桥，抗血凝，抗血小板聚集率等对症处理，但是这些改变血流变化的方案，会引发神经系统和心血管系统的并发症，往往需要严密的临床监测，急性外科手术治疗的安全性和有效性缺乏具体的数据支持。WU Bo等[11]对2004年前国家现用的中成药治疗中风的作用做出了系统评价，结果显示，无充分证据表明中成药对此有很好的治疗与预防效果，然因其无毒性和潜在的治疗意义，仍值得进一步研究。石磊等[12]研究表明电针干预可显著提高MCAO模型大鼠局部脑血流量，可同步提高梗死灶对侧半球局部脑血流量，由此可增加梗死区周围脑血流灌注。ZHANG Yannan等[13]研究表明针刺内关穴可以改善大鼠的运动功能，能增加脑血流量，缩小梗死病灶，即使在临床中细微改变肢体的运动功能也能较大程度改善患者的生活水平。本实验显示，针刺能够减轻脑水肿，较少神经元细胞的损伤，促进新生毛细血管的增生，从而达到保护脑组织的目的。

参考文献：

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marker of carotid atheroselerosis [J].stroke,2014,5(1):40.

[2]KENNY R,CAI G,BAYLISS J A,et al.Endogenous ghrelin's role in hippocampal neuroprotection after global cerebral ischemia:does endogenous ghrelin protect against global stroke [J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2013,304(11):980-989.

[3]丁波.缺血性脑卒中中医治疗的现代研究进展[J].中国民康医学,2010,22(15):1995-1996.

[4]方亮,张梓倩,王维群,等.脑卒中患者的功能评价与药物治疗的研究进展[J].中央民族大学学报(自然科学版),2010(3):78-82.

[5]LONGA E Z,WEINSTEIN P R,CARLSON S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[6]JIANG Bin,WANG Wenzhi,CHEN Honglei,et al.Incidence and trends of stroke and its subtypes in China:results from three large cities [J].Stroke a Journal of Cerebral Circulation,2006,37(1):63-68.

[7]杨文娟,王振才.脑卒中发病率的季节特性及年龄变化趋势[J].中西医结合心脑血管病杂志,2015(9):1123-1125.

[8]MICHAEL HLEV,ALAN Z SEGAL,JEFFERY FARKAS,et al.Utility of Perfusion-Weighted CT Imaging in Acute Middle Cerebral Artery Stroke Treated With Intra-Arterial Thrombolysis Prediction of Final Infarct Volume and Clinical Outcome[J].Stroke,2001,32(9):2021-2027.

[9]HAROLD P,ADAMS J R,ROBERT J.et al.Guidelines for the Early Management of Patients With Ischemic Stroke:A Scientific Statement From the Stroke Council of the American Stroke Association[J].Stroke,2003,34:1056-1083.

[10]梁磊,黄志恩,罗高权,等.双联抗血小板治疗非心源性缺血性脑卒中的疗效及安全性研究现状[J].解放军医学杂志,2014(2):167-171.

[11]WU Bo,LIU Ming,LIU Hua,et al.Meta-Analysis of Traditional Chinese Patent Medicine for Ischemic Stroke[J].Stroke,2007,38:1973-1979.

[12]石磊,杜元灏.脑梗死急性期局部血流量变化及电针干预效应研究[J].天津中医药大学学报,2012,31(2):85-87.

[13]ZHANG Yanan,SHA Yang,FAN Xiaonong,et al.Orthogonal design to sift the optimal parameter of Neiguan acupuncture for cerebral infarction[J].Stroke,2013,28:2641-2648.

Acupuncture on ultrastructure of the cortical ischemia semi-dark cells of rats with cerebral ischemia and reperfusion

XU Junfeng1,2,ZHANG Lang3,TIAN Qian1,GUO Shiming4，ZHENG Yaling5，WANG Xiaoqing5

(1.First Teaching Hospital of Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China;2.The Chinese Academy of Sciences of Postdoctoral Scientific Research in TCM,Beijing 100700;3.Zichang People’s Hospital,Shaanxi Province,Zichang 717300,Shaanxi Province,China;4.Dongli District Hospital of TCM,Tianjin 300300,China;5.Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China;)

Abstract：ObjectiveTo observe the effects of acupuncture on penumbra ultrastructure of the cortical ischemia semi-dark cells of rats with cerebral ischemia and reperfusion.MethodsFocal cerebral ischemia reperfusion rat model was made by modified longa's thread embolism method with paraformaldehyde perfusion and fixed by e and aldehyde.After double staining with uranyl acetate and lead citrate,HU-12A electron microscope was used to observe the ultrastructural change of the cortical ischemia semi-dark cells of rats with cerebral ischemia and reperfusion.ResultsIn the model group,the 6 h neurons were mild damaged,with the peripheral blood coagulation,blood vessels surrounding edema with obvious exudation,capillary lumen stenosis,cerebral tissue edema,and cerebral cell destruction.However,in the acupuncture group,5D postsynaptic neurons structure kept normal with blood vessels smooth,no damage in capillary endothelial cells,no edema,exudation,nor necrosis in cerebral tissue,and the in crease of newly born blood capillary.ConclusionAcupuncture can relieve cerebral edema,the damage of neuron cells,and promote the proliferation of new blood capillary,so as to protect brain tissue.

Keywords：acupuncture therapy;cerebral ischemia and reperfusion;ultrastructure of cortex

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.03.006

基金项目：国家科技支撑计划课题项目“名老中医临床经验学术思想传承研究”(2013BA13B031)；天津中医药大学第一附属医院拓新工程课题(201202)。

作者简介：许军峰(1974-)，女，医学博士，副主任医师，主要从事针灸治疗脑血管疾病及经筋病的研究。

中图分类号：R245.3

文献标志码：A

文章编号：2095-6258(2016)03-0455-03

(收稿日期:2015-09-10)