果树花药培养及单倍体植株鉴定研究进展

王广富，艾军，秦红艳，孙丹，范书田，杨义明

(中国农业科学院特产研究所，长春130112)

果树通常具有生长周期长、遗传背景复杂及自交亲和性差等特点，这使得果树常规育种耗时长、效率低，且获得纯系难度大。通过花药培养技术改变小孢子发育途径获得单倍体果树植株，进而对单倍体植株染色体加倍，可获得纯合的果树双单倍体植株，显著提高育种效率。且由于基因的纯合性，还可以提高基因作图和基因定位的准确性，因此，单倍体植株是果树优质育种、遗传转化以及分子生物学等研究领域的珍贵材料。近几十年来，果树花药培养取得了诸多成果，研究日益深入，下面对其成果进行综述与介绍。

1　单倍体植株获得途径

单倍体植株是指含有配子染色体数的植株。1921年，Bergner等人在曼陀罗植株中首次发现了天然的孢子体单倍体植株[1]，从此单倍体在植物育种和基因研究中的重要作用很快被广泛认知[2]。单倍体植株经染色体加倍产生纯合的双单倍体植株，可快速纯合优良杂交组合的优异基因，使植株的基因型和表现型完全一致，尤其在选择由隐性基因控制的优良性状时具有明显优势[3]。

单倍体植株的获得有自然发生和人工诱导2种途径。石庆华等报道，苹果、梨、桃、李、杏等许多果树能自然产生单倍体，但一般突变数量少，频率低，难以在生产实践中应用[4]。相比较而言，通过花药或小孢子培养、未授粉子房(胚珠)培养、远缘杂交等方法进行人工诱导，可显著提高植物单倍体的产生频率，其中花药或小孢子离体培养应用最为广泛[1]。

花药离体培养诱导单倍体植株的发生途径包括器官发生途径和直接或间接的胚状体途径。器官发生途径是指在一定条件下，愈伤组织中的分生细胞分化形成芽，再逐渐形成根，最后形成完整植株。胚状体发生途径是指愈伤组织细胞分化形成含胚芽、胚根、胚轴的胚状体结构，最后长成完整植株。相对器官发生途径，胚状体发生途径再生率高、再生速度快、结构完整，为研究植物细胞的发育、分化、全能性的表达和遗传转化等提供了良好的基础。

图1单倍体产生途径示意图

Fig.1Pathwaysofhaploidproductioninplants

2　果树花药培养研究概况

花药培养诱导单倍体是指在无菌条件下对未成熟的花药进行离体培养，改变其生长发育途径，诱导产生染色体减半的单倍体植株的培养方式。1953年，TULECK用银杏花粉第一次在人工培养基上成功地诱导形成单倍体愈伤组织[5]。Guha和Maheshwari(1964)首次经胚状体途径由毛叶曼陀罗花药成功地培养出单倍体植株[6]，使花药培养成为获得单倍体植株的高效新途径。花药培养技术的研究发展迅速，近30年来，已被广泛应用到200多种植物上，尤其在茄科和禾本科植物中成功较多[5]。

经果树学家们几十年的不懈努力，我国的果树花药组织培养研究取得较大进展，目前在世界上主要栽培的果树树种，我国都已获得了单倍体植株或愈伤组织[7]，例如柑橘(Citrus)、苹果(Malusdomestica)、西洋梨(Pyruscommunis)、桃(Prunuspersica)、甜樱桃(Prunusavium)、西洋李(Prunusdomestica)、普通杏(Prunusarmeniaca)、葡萄(Vitisvinifera)、猕猴桃(Actinidiadeliciosa)、桑(Morusalba)、番木瓜(Caricapapaya)、番荔枝(Annonasquamosa)、枇杷(Eriobotryajaponica)等。

3　果树花药培养获得单倍体植株的影响因素

3.1　外植体

3.1.1材料基因型基因型是某一生物个体全部基因组合的总称，又称遗传型。基因型是影响花药培养的重要因素之一，不同基因型的植株花药对培养条件的反应不同[8]。武晓红在枣花药培养的研究中发现，不同品种在相同条件下花药的出愈率不同，冬枣花药出愈率达到70.26%，阜平大枣仅为7.76%[9]。陈振光在柑橘花药培养研究中发现，供试植株的品种对花药培养的成败起关键作用[10]。Wang S M等研究发现，不同品种的柑橘花药在同一培养条件下的愈伤组织诱导率不同[11]。

3.1.2小孢子发育时期只有处于一定发育时期的花粉小孢子才对外界培养条件比较敏感，所以小孢子的发育时期是影响诱导花粉胚成功与否的关键因素[12]。植物种类不同，适宜接种时期也不尽相同。果树花药培养最佳时期大多数是小孢子核有丝分裂期前后，小孢子处于单核中晚期为宜[5]。处于单核期到双核早期的小孢子，刚好处于第1次有丝分裂阶段，适于诱导其向单倍体方向发育。

3.1.3母本植株的生长状况花粉粒的数量、内源激素的水平以及花药组织的营养状况都会受母本植株的生长状况的影响[13，14]，而这些因素都会对单倍体植株的获得起到重要作用[3]。一般来说，从生长健壮的幼年植株上采集花药作为接种材料，其花药培养相对于老龄树更易获得成功[15]。陈振光的研究发现，柑橘花粉对培养环境的反应能力随供体植株年龄的增加而降低[10]。供体植株的生长环境不同，花粉的发育状态不同，花药培养的效率不同。有研究指出，植株生长在长日照和低温条件下，其花粉的诱导率更高[16]。

3.2　预处理

有报道指出，在花药或花粉接种之前对整个花序或离体花蕾进行预处理可改变小孢子的发育途径，提高培养的成功率[2]。花药培养的预处理方式有很多，包括低温处理、热激处理、缺素处理、射线处理等，其中常用的预处理方式有低温处理和热激处理[17]。适宜的预处理温度和时间可提高胚产生的效率，诱导胚状体的产生。低温预处理温度一般在1℃～14℃，处理时间短则几个小时，长则30d～40d[12]。张春芬等在“红星”苹果花药培养低温预处理试验中发现，随着低温预处理时间的增加，胚状体诱导率呈增长趋势[18]。

3.3　培养基

3.3.1基本培养基基本培养基中包含植物组织培养所需要的大量元素和微量元素，是花药培养成功与否的关键因素之一。较为常用的基本培养基有MS、N6、B5、White、Nitsch等。研究表明，基本培养基中无机盐的成分配比对花药培养过程中愈伤组织的诱导有决定性的作用[15]。苹果“元帅”品种花药培养过程中MS培养基附加不同配比的激素均能诱导产生愈伤组织和胚状体，而N6培养基的各种处理均不能产生胚状体[19]。刘仁祥等提出，在一定的范围内，大量元素与微量元素的比率对成苗的影响要超过单一元素绝对含量的影响[20]。

3.3.2植物生长调节剂植物生长调节剂(生长素，细胞分裂素或二者组合)对花药培养过程中小孢子的发育途径有重要作用。在木本植物花药培养中，分化培养基需同时含有生长素和细胞分裂素才有利于小孢子再分化，而草本植物花药培养对生长调节剂的要求则无固定规律[21]。植物生长调节剂的成分及其含量可影响体细胞和单倍体细胞生长增殖，植物生长调节剂适宜的组合及浓度搭配能提高胚状体的形成率[22，23]。王震星等在金丝小枣花药培养过程中，培养基中附加2，4-D和NAA的浓度和配比不同，其愈伤组织诱导率差异显著[24]。

3.3.3碳源碳源不仅可以为植物组织培养提供能量，还可调节植物离体组织的渗透压。一定浓度范围内的碳源对抑制体细胞愈伤组织的生成具有一定作用，从而提高生殖细胞的愈伤组织生成率，比如在花药组织培养中，适当浓度的碳源可以降低花丝或花药壁的愈伤组织生成率，从而提高花粉胚的形成效率[25]。在花药培养中，碳源组分和浓度对花粉小孢子的活力以及胚状体发生有重要影响[12]。常用的碳源有果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇等，其中，蔗糖最为常用。薛光荣等用不同浓度的蔗糖处理“元帅”苹果离体花药，其愈伤组织及胚状体的诱导率不同[19]。

3.4　培养条件

离体花药一般是培养在温度24℃～27℃、每天光照10h～14h、光强2000lux的环境下，也有一些其他的培养条件。不同基因型的植物适宜的培养条件不同，光照是调节离体花药形态发生的环境信号，光照强度和光周期是花药培养过程中重要的调节因子。花药在离体培养过程中对温度比较敏感[26]，前期的冷处理或者是热处理能显著影响胚状体和再生植株的数量[27]。所以适宜的培养条件能提高花药离体培养的成功率。

4　再生植株倍性鉴定

在花药培养过程中，由于体细胞(花药壁、药隔、花丝等)干扰、单倍体自然加倍等情况的存在，再生植株的倍性比较复杂，所以对再生植株进行有效地倍性鉴定具有重要的意义。倍性鉴定方法主要包括：

4.1　形态学鉴定

形态学鉴定是指根据植株器官形态、颜色等的差异来进行倍性识别[1]。单倍体植株和二倍体、多倍体植株的区别比较明显，一般来说，单倍体植株生长缓慢甚至死亡，器官体积小，叶片窄小，叶及果实的形状异常[15]。Einset 1945年就已报道了染色体加倍的苹果芽变植株茎干粗壮，还出现了“大果”或“巨果”[28]。田义等发现“寒富”苹果花药培养植株与亲本植株相比叶片变小、变薄，叶被茸毛也大幅度减少[29]。形态学鉴定简便直观，但不够精确，需结合其他方法判定植株的具体倍性。

4.2　解剖学鉴定

植物叶片单位面积上的气孔数、保卫细胞大小以及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与植株倍性具有一定的相关性[17]。通常情况下，单倍体与正常植株相比，叶片下表皮的气孔保卫细胞变小，叶绿体数目变少，因此气孔的变化可用来间接鉴定植株倍性[12]。Blasco等发现，枇杷植株单位叶面积上的气孔数量和气孔的面积与植株的倍性呈正相关，在所测二倍体和三倍体、四倍体样品植株之间差异显著，可作为鉴定植株倍性的重要依据[30]。

4.3　染色体计数

单倍体细胞含有正常二倍体细胞半数的染色体，选取处于有丝分裂中期的细胞进行染色体计数，可准确地鉴定花药培养再生植株倍性[31]。在葡萄[32]、苹果[33]、草莓[34]、柑橘[35]等许多果树都使用染色体计数的方法对花培植株进行了倍性鉴定[1]。常用的染色体计数法包括根尖或茎尖常规压片法及去壁低渗火焰干燥法制片，所选细胞所处的时期及染色体的分散程度都会对鉴定结果产生影响[15]。

4.4　流式细胞仪法鉴定

流式分析仪又称倍性分析仪，可定量地测定某一细胞以及细胞群中的DNA含量，利用流式细胞仪进行倍性鉴定简便、快捷，且准确度高[36]。流式细胞仪检测器可捕捉经DNA特异性染料染色后的单细胞悬浮液中的细胞核所发射的荧光信号，通过直方图进行多参数、快速定量分析，进而推断出细胞的倍性[15]。李等利用流式细胞光度术测定苹果细胞核DNA含量结果表明，不同倍性品种间细胞核DNA含量差异显著，利用流式细胞仪法可以较为可靠地进行苹果倍性鉴定[37]。流式细胞仪已被用于柑橘[38]、甜柿[39]、葡萄[40]等果树的倍性鉴定，且鉴定结果准确。

4.5　分子水平鉴定

花药培养中的单倍体植株在生长过程中有自然加倍的现象，用染色体计数法和流式细胞仪分析法无法鉴定植株的倍性起源[15]。通过RFLP、AFLP、SSRs(又称微卫星分子标记)、SCAR分子标记、指纹图谱、基因组原位杂交(GISH)、荧光原位杂交(FISH)等技术可在分子水平上对再生植株进行纯合性鉴定[3]。SSRs因其是共显性标记，可以应用于双单倍体的鉴定与筛选上。已被用来进行柑橘花药培养再生植株的特征研究[41]及判定梨[42]和苹果植株[43]的纯合性。

5　果树花药培养存在的问题和展望

我国的果树花药培养起步于20世纪70年代，在科学家们过去几十年的辛勤努力下，我国果树花药培养技术已取得较大进展，但果树花药培养技术依然存在一些问题和阻碍。①基因型依赖，果树花粉的培养力受多基因调控，目前果树的花药培养技术依然落后于禾本科植物，许多重要果树依然没有通过花药培养成功获得单倍体植株；②果树愈伤组织再生困难，单倍体植株的诱导率较低，且部分已报道成功获得花药单倍体植株的果树，其培养的结果重演性差；③体细胞干扰，花药培养属于器官培养，花药壁及花丝等体细胞会干扰诱导结果；④单倍体一般植株矮小，生长势弱，甚至难以存活。今后应加强在上述领域的研究，不断深入果树花药培养研究，改进培养机制，完善花药培养技术体系，提高果树单倍体植株的诱导率和存活率，以便与传统杂交育种等技术相结合，培育出更多优良新品种，同时为果树分子标记、遗传图谱构建等研究提供理想的研究材料，并将促进果树遗传育种、遗传转化等研究快速发展。

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