基于激光共聚焦显微镜λ扫描检测蒿草切片荧光光谱的研究

吴伟全，李元歌，王思捷，杨腾，吴平(、广东医学院临床医学研究中心，广东湛江5400；、广东医学院附属医院放射科，广东湛江5400)



基于激光共聚焦显微镜λ扫描检测蒿草切片荧光光谱的研究

吴伟全1，李元歌2，王思捷1，杨腾1，吴平1
(1、广东医学院临床医学研究中心，广东湛江524001；2、广东医学院附属医院放射科，广东湛江524001)

摘要：目的研究激光扫描共聚焦显微镜λ扫描检测蒿草切片的荧光光谱，为基于共聚焦显微镜获得生物医学样本的荧光光谱提供理论和实验依据。方法运用普通荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜分别观察荧光染色的蒿草切片，实验分为三组：A组用普通荧光显微镜观察并拍照；B组用激光扫描共聚焦显微镜检测荧光光谱；C组用激光扫描共聚焦显微镜扫描荧光图像。结果荧光显微镜可以观察到蒿草切片的荧光图像，但不能准确获取其相应荧光激发和发射波长，而且会发生串色干扰现象。激光扫描共聚焦显微镜能对蒿草切片进行荧光光谱扫描，排除了干扰波长，获取其荧光激发和发射波长，得到高清晰度的荧光图像。结论与普通荧光显微镜比较，激光扫描共聚焦显微镜有能准确获取样本荧光光谱，得到高清晰度荧光图像的优点。

关键词：激光共聚焦显微镜；蒿草切片；荧光；光谱分析

随着生物医学的研究发展，获得生物医学样本的荧光光谱在生物医学研究中越来越重要[1]。荧光显微镜可以观察到其荧光图像，但不能准确获取其相应荧光激发和发射波长[2]。随着激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope，LSCM)的发展，其λ扫描功能可以扫描生物医学样本的荧光光谱，但目前相关的研究较少，有待深入研究[3]。因此本研究使用激光扫描共聚焦显微镜λ扫描功能检测生物医学样本的荧光光谱，获取其相应的荧光激发和发射波长，并准确获得其荧光图像，为基于激光扫描共聚焦显微镜获得生物医学样本的荧光光谱提供理论和实验依据。

1　资料与方法

1.1材料与仪器采用德国Leica公司广州分公司的多种混合荧光染料染色蒿草切片，蒿草切片制片共有18张，分为A、B、C三组，每组6张。A组用普通荧光显微镜观察并拍照；B组用激光扫描共聚焦显微镜λ扫描检测其的荧光光谱；C组用激光扫描共聚焦显微镜扫描其荧光图像。Leica T CSSP5 II激光扫描共聚焦显微镜（德国）；奥林巴斯IX70普通荧光显微镜（日本）。

1.2普通荧光显微镜观察蒿草切片并拍照蒿草切片制片后置于奥林巴斯IX70荧光显微镜载物台上，分别以紫外光（360~380nm）、蓝光（460-490nm）、绿光（520-550nm）为激发光源激发样品，观察图像，图像由Leica DFC295数码摄像头拍摄记录。

1.3激光共聚焦扫描显微镜λ扫描分析蒿草切片，LAS软件分析其荧光光谱蒿草切片制片后置于德国Leica公司的TCSSP5激光扫描共聚焦显微镜的载物台上，调焦选择理想的扫描层面。分别用405nm、488nm、543nm等3种波长激发光激发样品进行λ扫描分析。扫描模式为xyλ，分辨率（format）为1024×1024；扫描速度(speed)为200Hz；针孔大小(pinhole)为1Airy；放大倍数(zoom)为1.0，接收的带宽(Band Width)为5nm。扫描蒿草切片的荧光光谱，每张片扫描3次。采用Leica LAS软件分析其荧光光谱，获取其相应荧光激发和发射波长范围。

1.4激光扫描共聚焦显微镜扫描获取蒿草切片荧光图像基于激光扫描共聚焦显微镜，输入Leica LAS软件分析获得的蒿草切片相应荧光激发和发射波长，扫描方式（mode）为XYZ；分辨率（format）为1024×1024；扫描速度(speed)为200Hz；针孔大小(pinhole)为1Airy；放大倍数(zoom)为1.0。手动调节Z轴位置至清晰的焦平面，扫描获取二维平面图像。

2　结果

2.1普通荧光显微镜观察蒿草切片的荧光图像紫外光（波长360~380nm）激发得到的蒿草切片蓝色荧光图像；蓝光（波长460~490nm）激发得到的蒿草切片荧光图像，呈黄色，绿色光为主，与串色的红色光叠加所致；绿光（波长520~550nm）激发得到的蒿草切片红色荧光图像。（见图1A、1B和1C）

图1　普通荧光显微镜观察并拍照（×40）

2.2激光扫描共聚焦显微镜λ扫描分析蒿草切片的荧光光谱用405nm、488nm和543nm波长激发光分别激发样品进行λ扫描，LAS软件分析光谱峰值，得到相应敏感的荧光发射波长范围分别为490~510nm、510~530nm和560~580nm。（见图2A、2B和2C）

图2　激光扫描共聚焦显微镜λ扫描分析蒿草切片的荧光光谱

2.3激光扫描共聚焦显微镜扫描获取蒿草切片荧光图像用405nm、488nm和543nm波长激发光分别激发样品，对应使用其相应敏感的荧光发射波长范围为490-510nm、510-530nm和560-580nm，分别可以得到清晰的蒿草切片共聚焦荧光图像（见图3A、3B和3C）。

图3　激光扫描共聚焦显微镜扫描获取蒿草切片荧光图像（×100）

3　讨论

生物医学样本的荧光光谱已经成为研究其性质和功能一个重要方法[4]。但目前很多生物医学样本的荧光光谱是未知的[5]。随着生物医学的研究发展，获取生物医学样本的荧光光谱，从而准确采集生物医学样本的荧光图像在生物医学研究中越来越重要。

荧光显微镜是研究生物医学样本的基本工具，是用一定波长的光去激发标本，从而发射出荧光，然后通过物镜和目镜系统可以观察到标本的荧光图像[6-8]。荧光显微镜可以观察到部分未知荧光光谱的生物医学样本荧光图像，但不能准确获取其相应荧光激发和发射波长，而且多种荧光染料染色时会发生串色干扰现象[9]。本研究中的普通荧光显微镜图像结果也反映了这个现象。

激光扫描共聚焦显微镜是一种新型的先进的光学显微镜，用激光做光源，采用共轭聚焦原理和装置，避免了衍射光和散射光的干扰，并利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理观察、分析和输出，因而其图像清晰度高[10-12]。与普通荧光显微镜相同样本的图像比较，本研究显示激光扫描共聚焦显微镜的图像清晰度较高，与相关研究一致[13，14]。随着激光扫描共聚焦显微镜的快速发展，其λ扫描功能可以扫描生物医学样本的荧光光谱。本研究通过λ扫描对生物医学样本进行光谱扫描，再采用软件分析其荧光光谱，排除了干扰波长，获取其相应的荧光激发和发射波长，并且根据其激发和发射波长进一步扫描得到了高清晰度的共聚焦荧光图像。

蒿草为一种草本植物，茎呈圆柱形。其茎断面结构清楚，荧光染色容易，制成切片很适合显微镜观察[15]。本研究通过激光扫描共聚焦显微镜λ扫描检测蒿草切片的荧光光谱，明确其相应荧光激发和发射波长，为生物医学样本荧光光谱分析提供新思路，为将来基于激光扫描共聚焦显微镜获得生物医学样本的未知荧光光谱提供理论和实验依据，具有一定的科学价值，社会、经济效益。

参考文献

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[15]吴伟全，李元歌，王思捷，等.基于蒿草切片对比分析激光共聚焦系统的三维重构成像及二维平面成像的应用价值[J].现代医院，2013，13(7)：21-23.

Study on the fluorescence spectrum of wormwood slice w ith laser scanning confocalm icroscope

WUWeiquan1，LIYuange2，WANG Sijie1，YANG Teng1，WU Ping1.1.Clinical Research Center，Guangdong Medical University，Zhanjiang Guangdong 524001，China；2.Radiology Department，Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Zhanjiang Guangdong 524001，China.

Abstract：Objective To study the fluorescence spectrum of wormwood slice with laser confocalmicroscope，and provide the theoretical and experimental basis for obtaining the fluorescence spectrum of biomedical samples.M ethods The fluorescencemicroscope and laser scanning confocalmicroscope were used to observe fluorescence of wormwood slice.The experiment included three groups：group A，using fluorescence microscope to take photos；group B，using laser scanning confocalmicroscope to detect fluorescence spectrum；group C，using laser scanning confocalmicroscope to obtain fluorescence image.Results The fluorescence microscope could observe the fluorescence image of wormwood slice，but could not accurately obtain the corresponding fluorescence excitation and emission wavelength.The channeling color interference phenomenon was occurred.The laser scanning confocalmicroscope could scan the fluorescence spectrum of wormwood slice，exclude the interference wavelength，obtain the fluorescence excitation and emission wavelength accurately and gather fluorescent image with high-resolution.Conclusion Compared with the fluorescence microscope，the laser scanning confocal microscope can accurately obtain the fluorescence spectrum and high-resolution fluorescence image of biomedical samples.

Key words：Laser scanning confocalmicroscope；Thewormwood slice；Fluorescence；Spectral analysis

(收稿日期2015-11-11；修回日期2015-12-30)

通信作者：吴平，主任技师，主要从事医学基础研究。

作者简介：吴伟全，男，1978年5月生，硕士学位，助理研究员，主要研究方向：共聚焦相关医学基础研究。E-mail:wwqjob@163.com

基金项目：广东医学院科研基金项目（M2014044）

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.007

中图分类号：R318.51

文献标识码：A

文章编号：1674-1129(2016)01-0021-03