基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在真菌快速鉴定中的应用

王　欢，曲　芬



·导向与述评·

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在真菌快速鉴定中的应用

王欢，曲芬

［摘要］真菌是广泛分布于自然界的真核生物，对人类具有致病性的约300种。不同种真菌的生长特性、临床特点及耐药性不同。真菌生长缓慢，传统的培养鉴定方法所需时间较长，且日益多样化的真菌，使鉴定难度不断增加，这些均限制了临床的早期诊断和针对性治疗。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF MS）是一种新兴的诊断技术，可以通过直接检测生物标志物（蛋白）来鉴定病毒、细菌、分枝杆菌等，具有操作简便、快速、准确率高、成本低的特点。本文对MALDI-TOF MS在真菌鉴定中的应用进行综述，发现其对酵母样真菌的正确鉴定率可达到94％以上，丝状真菌正确鉴定率也可达到89％，可满足临床实验室鉴定真菌的需求。

［关键词］光谱法，质量，基质辅助激光解吸电离；真菌；感染

DOI∶ 10.3969/j.issn.1007-8134.2016.03.002

近年来，随着广谱抗菌药物的广泛应用，器官移植和导管技术的开展，以及肿瘤患者和接受免疫抑制药物治疗的患者逐年增多，真菌（如假丝酵母菌属、隐球菌属和曲霉菌属等）感染成为危及这类患者生命的主要因素。全球每年约有7280万假丝酵母菌感染病例，在美国假丝酵母菌属是引起医源性血流感染的第4大常见病原菌；其中白假丝酵母菌成为最重要的致病真菌［1］。目前，已知有100余种酵母样真菌确定为人类病原体，并在几乎所有的人身体部位被分离出来。真菌的特点是培养生长缓慢，实验室常规鉴定和药物敏感性（药敏）实验时间长，对临床的早期诊断和治疗造成困难，导致真菌感染的病死率升高［2］。早期、快速、准确地诊断真菌感染是临床及时救治真菌感染的关键［3］。然而，日益多样化的真菌使鉴定真菌病原体难度不断增加，常规鉴定方法的鉴定能力已显不足，尤其对不常见的真菌，结果有时还不确定［1］。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF MS）是近年快速发展起来的一种新型软电离生物质谱，具有强大的鉴定能力。自2009年开始用于真菌的鉴定［1］，具有操作简便、鉴定迅速、准确率高和成本低的特点，可替代微生物实验室对真菌的常规检测方法［4-8］。本文就MALDI-TOF MS在真菌鉴定和真菌药敏检测方面的应用进行综述。

1　MALDI-TOF MS的检测原理

MALDI-TOF MS主要由2部分组成——基质辅助激光解吸电离离子源（matrix-assisted laser desorption ionization， MALDI）和飞行时间质量分析器（time of flight， TOF）。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，使生物分子电离的过程。因此，它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同，测定离子的质荷比（M/Z）。不同菌的蛋白表达不同，通过MALDI-TOF MS得到的蛋白质图谱也不同，将待测菌的蛋白质图谱与数据库中的进行比对，根据图谱的匹配度，得出鉴定结果和相应的鉴定分值，分值越高，匹配度越好，结果越可信。

2　MALDI-TOF MS在真菌鉴定中的应用

2.1MALDI-TOF MS在酵母样真菌鉴定中的应用对酵母样真菌临床上常用的鉴定方法有科玛嘉显色培养法以及VITEK 2和API ID 32C鉴定法。这些方法对常见真菌（白假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌）的鉴定正确率可以达到92％～96％［9］，但鉴定种类有限，耗时达24～72 h，成本高，对某些酵母菌鉴定准确度差。例如，这些方法不能将近平滑假丝酵母菌与拟平滑假丝酵母菌和似平滑假丝酵母菌区分开，同样不能把光滑假丝酵母菌与Candida bracarensis和Candida nivariensis区分开［10］。国外的快速胶乳凝集测定，虽然快速、精确，但也只能鉴定若干种，而且步骤复杂、价格昂贵［11］。分子生物学测序是鉴定的“金标准”［9，12-13］，但实验对人员、环境和设备要求高，鉴定周期长，价格高，并且存在环境污染的高风险，不能用作实验室的常规检测［13］。

2009年Marklein等［1］第1次用MALDI-TOF MS对250株假丝酵母菌进行了鉴定研究。采用Microflex质谱仪（Bruker Daltonics 公司，德国）和FlexControl 3.0软件，单株菌的鉴定只需10 min，3 h可以完成96株菌的检测。分别采用MALDI Biotyper软件的1.1和2.0版本同时进行分析，得到了96％的鉴定正确率，共正确鉴定14种酵母菌（白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、乳酒假丝酵母菌、葡萄牙假丝酵母菌、挪威假丝酵母菌、皱褶假丝酵母菌、都柏林假丝酵母菌、解脂假丝酵母菌、西弗假丝酵母菌、菌膜假丝酵母菌和季也蒙假丝酵母菌）。由于数据库中没有挪威假丝酵母菌、皱褶假丝酵母菌、都柏林假丝酵母菌和西弗假丝酵母菌相应的图谱，这几种菌没有被正确鉴定。2010年Stevenson等［14］报道MALDI Biotyper软件的2.0.4版本对所研究的194株假丝酵母菌鉴定正确率达99％，且这些菌种图谱都囊括在数据库中。

2011年Seyfarth等［15］将采用MALDI-TOF MS 和API ID 32C对酵母样真菌鉴定的结果进行比对，并用分子生物学测序方法进行验证，结果显示MALDI-TOF MS的鉴定正确率为94.0％，API ID 32C的鉴定正确率为84.3％。采用MALDI-TOF MS鉴定克柔假丝酵母菌全部正确，而API ID 32C则把克柔假丝酵母菌鉴定为挪威假丝酵母菌、热带假丝酵母菌等其他假丝酵母菌。Marklein等［1］也曾对250余株酵母样真菌做了同样的比对实验，结果显示API ID 32C的鉴定正确率为93.6％，MALDITOF MS的鉴定正确率达到98.0％，与Seyfarth等［15］的结果略有差异。Yaman等［16］采用MALDI-TOF MS和VITEK 2对281株从血培养中分离出的酵母样真菌进行鉴定，经比对二者94％的结果一致，对不一致的结果进行了分子生物学鉴定，其结果与MALDI-TOF MS鉴定结果相同，MALDI-TOF MS对菌属的鉴定正确率达到了100％。国内也有类似的研究，靳颖等［17］采用同样的比对方法对150株酵母样真菌进行鉴定，MALDI-TOF MS鉴定正确率在属水平上为100％，种水平上为94％，与国外报道一致。

Westblade等［18］采取直接将菌株点靶，在上面覆盖甲酸的方法，对852株菌共31个种进行评价，其中包括20种626株假丝酵母菌，35株新型隐球菌和191株其他酵母样真菌，比对“金标准”采用26S rRNA序列分析。结果显示823株（96.6％）在属的水平鉴定正确，819株（96.1％）在种的水平鉴定正确。24株（2.8％）没有查明，5株（0.6％）被错误鉴定。其中1株白假丝酵母菌被错误鉴定为都柏林假丝酵母菌，1株近平滑假丝酵母菌被错误鉴定为菌膜假丝酵母。研究者还对不同种的假丝酵母菌的鉴定正确率进行了统计，白假丝酵母菌为98.3％，都柏林假丝酵母菌为100％，无名假丝酵母菌为96.6％，光滑假丝酵母菌为100％，季也蒙假丝酵母菌为97.2％，希木龙假丝酵母菌为100％，平常假丝酵母菌为100％，中间假丝酵母菌为100％，乳酒假丝酵母菌为100％，克柔假丝酵母菌为100％，郎比可假丝酵母菌为100％，解脂假丝酵母菌为100％，葡萄牙假丝酵母菌为87.9％，挪威假丝酵母菌为96.7％，近平滑假丝酵母菌为98.6％，菌膜假丝酵母菌为100％，皱褶假丝酵母菌为100％，热带假丝酵母菌为90.7％，产朊假丝酵母菌为100％，诞沫假丝酵母菌为100％。其他酵母样真菌鉴定正确率分别为新型隐球菌100％，奥默柯达菌90.9％，糠秕马拉色菌85.7％，粘质红酵母菌100％，阿氏丝孢酵母菌93.8％，粘性丝孢酵母菌88.9％。

近年来研究发现近平滑假丝酵母菌通过基因分型可以分为近平滑假丝酵母菌、似平滑假丝酵母菌和拟平滑假丝酵母菌3个组，3者之间对药物的敏感性存在差异，特别是对棘白菌素类抗真菌药［19-20］。这表明物种鉴定可能对治疗产生影响。Quiles-Melero等［21］对77株临床分离的近平滑假丝酵母菌复合群进行了MALDI-TOF MS分型，并用分子生物学方法进行验证，符合率为100％。这表明通过MALDI-TOF MS可以对近平滑假丝酵母菌复合群进行准确的种内分型，更好地指导临床用药。

2.2MALDI-TOF MS在丝状真菌鉴定中的应用丝状真菌感染常侵犯免疫功能低下的患者，特别是进行化疗、激素治疗或造血干细胞移植中性粒细胞减少的患者，其他有感染风险的是糖尿病、恶性血液病、人器官移植或大面积烧伤的患者以及HIV感染者［22-23］。临床实验室对丝状真菌一直是依靠培养后镜下观察其形态特点和产孢方式，并结合菌落生长的形态和颜色等鉴定，这需要检验人员有丰富的丝状真菌鉴定经验。丝状真菌培养通常需要72 h以上才能呈现较明显的菌落特点，如果镜下不能确定，再经过测序鉴定，往往要耗费7 d左右的时间，患者往往已经错过了最佳治疗时间。

国外有实验室尝试用MALDI-TOF MS对丝状真菌进行鉴定。Ranque等［9］选取了58种共625株丝状真菌，应用传统的方法和MALDI-TOF MS同时鉴定，并用测序方法进行确认，鉴定正确率分别为80％和89％。对非曲霉菌类的丝状真菌，MALDI-TOF MS的鉴定能力较传统方法提高了31％～61％。研究表明，MALDI-TOF MS对曲霉菌、青霉菌、毛癣菌、镰刀菌、木霉和毛霉目这几种丝状真菌鉴定效果较好。也有文献报道，MALDI-TOF MS对曲霉菌的鉴定正确率可以达到98.4％［24］。

Hettick等［25-26］分别选取了12种曲霉菌和12种青霉菌进行研究，属的鉴定正确率均达到了100％，种的鉴定正确率为95％。也有研究者使用MALDI-TOF MS成功识别了6种青霉属菌株［27］。

国内鲜有应用MALDI-TOF MS对丝状真菌鉴定的报道。丝状真菌因其蛋白提取困难，目前没有规范的提取操作规程，且MALDI-TOF MS的数据库中相关图谱有限，所以其对丝状真菌的鉴定能力与对酵母样真菌的鉴定相比稍显逊色，还须不断扩充新的图谱数据库，优化统一操作，以增强鉴定丝状真菌的能力。

2.3MALDI-TOF MS对真菌药敏检测的研究真菌感染的增加使其耐药性呈现上升趋势，尤其是酵母样真菌对治疗中常用到的氟康唑的耐药率达到19.66％［28］。Marinach等［29］用MALDI-TOF MS检测白假丝酵母菌对氟康唑的敏感性。将氟康唑的药物浓度连续稀释，从128 mg/ml到0.125 mg/ml，并将不同浓度的氟康唑和白假丝酵母菌进行15 h的混合培养，经过处理萃取后，通过MALDI-TOF MS分析上清液得到图谱，图谱发生改变的最低药物浓度称为最小剖面变化浓度。将最小剖面变化浓度与临床实验室标准化协会的最小抑菌浓度值进行比对，发现1个稀释度内的结果一致率为94％。MALDI-TOF MS对真菌药敏检测的研究还在起步阶段，将来有可能替代现有的药敏检测方法，得到快速准确的药敏结果。

3　MALDI-TOF MS在真菌鉴定中的应用前景

MALDI-TOF MS检测真菌稳定性较强、重复性好、操作简便快速、成本低、鉴定种类多且结果准确，是临床实验室鉴定真菌的一种快速、可靠的方法［16］，大大缩短了临床微生物实验室检测真菌的报告时间。对于丝状真菌的蛋白提取方法，目前尚无统一的操作规范，所以MALDI-TOF MS对丝状真菌的鉴定能力还有待进一步研究。应用中发现，MALDI-TOF MS的丝状真菌数据库中，还有很多菌种的图谱没有包含，这也为实验室提供了更大的拓展空间，实验室可以根据自身的特点，建立个性化的数据库，提高检测效率和准确性［30］。MALDITOF MS以其诸多的优点，逐渐替代微生物实验室鉴定真菌的传统方法。MALDI-TOF MS检测真菌药敏的研究，将为准确、合理地应用抗真菌药物治疗临床真菌感染提供快速、有力的依据［31］。

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（2015-11-04收稿 2016-01-21修回）

（责任编委 李 军 本文编辑 王 姝）

［文献标志码］［中国图书资料分类号］ R379 A

［文章编号］1007-8134（2016）03-0129-04

*Corresponding author， E-mail： qf302@163.com

［基金项目］首都卫生发展科研专项基金（2011-4001-09）

［作者单位］100039 北京，解放军第三〇二医院临床检验医学中心（王欢、曲芬）

［通讯作者］曲芬，E-mail∶ qf302@163.com

Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for rapid identification of fungi

WANG Huan， QU Fen*
Clinical Laboratory Center， 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China

［Abstract］Fungi are widely distributed in nature， and about 300 species of fungi are pathogenic to humans with different growth characteristics， clinical features and drug resistance. As fungi are slowly growing microorganisms， the culture and identification of fungi by conventional methods are time-consuming. In addition， the increasing diversity of fungal pathogens makes the identification more difficult. All these restrict the early diagnosis and targeted therapies. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS） is an emerging diagnostic technique in recent years， which can identify viruses， bacteria， mycobacteria and so on through direct detection of biomarkers （proteins）. It is a simple and fast diagnostic method with high accuracy and low cost. This review focuses on the identification of fungi by MALDI-TOF MS. Studies have shown that correct identification by MALDI-TOF MS is observed in more than 94％ of yeast-like fungi， and 89％ of filamentous fungi. Therefore， MALDI-TOF MS proves to meet the demand for the identification of fungi in clinical laboratory.

［Key words］spectrometry， mass， matrix-assisted laser desorption-ionization； fungi； infection