基于铂/碳球的乙酰胆碱酯酶传感器在农药乐果检测中的应用研究

吴丽娜，曹锡忠，蔡建和

(江苏出入境检验检疫局，江苏　南京　210001)



基于铂/碳球的乙酰胆碱酯酶传感器在农药乐果检测中的应用研究

吴丽娜*，曹锡忠，蔡建和

(江苏出入境检验检疫局，江苏南京210001)

摘要：基于农药乐果对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，构建生物传感器，实现了农药乐果的快速、高灵敏检测。合成了纳米材料铂/碳球(Pt/Cs)，利用其比表面积大、导电性好的优势，构建乙酰胆碱酯酶(AChE)传感器。铂/碳球修饰电极比裸电极的阻抗更低，峰电流增加了147.06%，说明该材料能很好地保持酶的催化活性。在最优实验条件下，用AChE传感器检测农药乐果，在1.0×10-9~1.0×10-6g/L范围，乐果浓度的负对数与抑制率呈良好的线性关系,其检出限为7.3×10-12g/L(按抑制率为10%计算)。对纺织品样品进行加标回收实验，测得回收率为86.2%~101.7%。

关键词：铂/碳球；生物传感器；乙酰胆碱酯酶;乐果；纺织品

有机磷农药因效果好、成本低，在我国农村得到了广泛应用。但其在使用过程中，会残留在食品、纺织品中，进入人体，对人体产生致癌、致畸作用，近年来已被明确禁止使用。目前有机磷农药的检测方法中气相色谱-质谱法应用最为普遍，但针对热稳定性差的农药(如乐果等)存在重现性差、结果不稳定的问题，而且检测成本较高、时间长、操作复杂，只适合在实验室进行，不适于现场实时检测[1]。

电化学酶传感器法由于成本低、灵敏度高、样品用量少等优点，成为有机磷农药的重要分析方法之一。近年来多种基于乙酰胆碱酯酶(AChE)或者有机磷水解酶的电化学或光学传感器在有机磷农药的检测中发挥了重要作用[2-5]。为了保护和提高酶的活性，提高传感器的灵敏度，金胶纳米粒子、碳纳米管等纳米材料被应用于电化学传感器中[6-11]。与碳纳米管相比，碳球具有能够负载客体分子的多孔纳米结构,粒度大小较均匀和较好的稳定性等优点[12-15]。而纳米铂则具有良好的导电性和生物相容性，被广泛地应用于酶或生物分子的固定[16-17]。

本文合成了一种纳米复合材料铂/碳球，并利用其比表面积大、电子传导性好的优势，制备了灵敏的AChE传感器，用于检测有机磷农药乐果。该传感器具有较好的灵敏度、重现性和稳定性。目前尚未见该材料用于农药乐果检测的报道。

1实验部分

1.1试剂与仪器

氯化硫代乙酰胆碱(ATCl，Sigma公司)，AChE(C3389型，500 U/mL，Sigma公司)，乐果标准溶液(分析纯，中国药品生物制品检定所)。实验所用的化学试剂均为分析纯。

电化学实验在电化学工作站CHI-660E(上海辰华仪器有限公司)上进行，实验采用三电极系统，玻碳电极(GC)为工作电极，铂(Pt)电极为对电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极为参比电极。

1.2实验内容

1.2.1碳球和铂/碳球材料的制备碳球和铂/碳球根据参考文献[18]制备，具体如下：碳球的制备以甲醛-间苯二酚为先驱体，采用Stöber方法，在8 mL乙醇与 20 mL去离子水的混合溶液中加入0.1 mL氨水(25%，质量分数)，1 h后，加入0.2 g间苯二酚，搅拌至完全溶解后，再滴加0.284 mL甲醛溶液(37%)，混合液在30 ℃搅拌24 h，然后将混合液移至水热釜中，100 ℃反应24 h，混合物经离心分离，100 ℃下干燥48 h。然后进行炭化处理，以1 ℃/min的升温速率加热至350 ℃，保持2 h，再以1 ℃/min加热至600 ℃，煅烧4 h，自然冷却至室温。

铂/碳球采用乙二醇还原法制备，步骤为：取80 mg碳球加至150 mL乙二醇溶液中，超声分散30 min后得到均匀碳浆，缓慢加入含20 mg Pt的氯铂酸溶液，搅拌2 h后，滴加0.5 mol/L NaOH溶液调至pH 10.0，升温至130 ℃还原3 h。冷却后真空抽滤，得黑色产物，用大量的去离子水洗涤，50 ℃干燥12 h，得到铂/碳球纳米复合材料。

1.2.2电极制备分别取稀释至120 U/mL的AChE、0.5%戊二醛和1%的牛血清蛋白按体积比1∶1∶1混合，用交联法将6 μL 1∶1∶1的酶混合液固定到裸电极表面，制作AChE/GC电极。分别取5 μL的Cs和Pt/Cs以及6 μL酶混合液，依次滴涂到电极表面，制作AChE/Cs/GC电极和AChE/Pt/Cs/GC电极。

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1.2.3纺织品样品溶液的制备纺织品样品先剪碎成5 mm×5 mm碎片，称取1 g，加入5 mL 0.2 mmol/L磷酸盐缓冲液，90 ℃超声提取30 min后，冷却待用。

2结果与讨论

2.1电极的电化学表征

图1　GC(a)、Cs/GC(b)、Pt/Cs/GC(c)电极在5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的循环伏安图Fig.1　Cyclic voltammograms of bare(a), Cs(b) and Pt/Cs(c) modified electrodes in 5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-scan rate:0.1 V/s

图2　GC(a)，Cs/GC(b)，Pt/Cs/GC(c)，AChE/Pt/Cs/GC(d)电极在5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的交流阻抗图Fig.2　Electrochemical impedance spectra of bare(a),Cs(b),Pt/Cs(c)and AChE/Pt/Cs(d) modified electrodes in 5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-

图3　AChE/GC(a)，AChE/Cs/GC(b)，AChE/Pt/Cs/GC(c)电极在含1.5 mmol/L ATCl的PBS缓冲液中的差分脉冲图Fig.3　Differential pulse stripping voltammetric curves of AChE(a), AChE/Cs(b), AChE/Pt/Cs(c)modified electrodes in PBS containing 1.5 mmol/L ATCl

图4　在含1.5 mmol/L ATCl的PBS缓冲液中加入2.0×10-3 g/L乐果标液前(a)后(b)AChE/Pt/Cs/GC修饰电极的差分脉冲伏安图Fig.4　Differential pulse stripping voltammetric curves of AChE/Pt/Cs modified electrodes in PBS containing 1.5 mmol/L ATCl without(a)and with 2.0×10-3 g/L dimethoate(b)

在5 mmol/L铁氰化钾溶液中，依次对裸玻碳电极(GC)、碳球修饰电极(Cs/GC)、铂/碳球修饰电极(Pt/Cs/GC)进行循环伏安扫描，结果如图1所示。由图1可知，GC电极的氧化峰电流为49.77 μA，Cs/GC电极的氧化峰电流为59.21 μA，峰电流升高了18.97%，Pt/Cs/GC电极的氧化峰电流为78.78 μA，峰电流升高了58.29%。由此可知，玻碳电极在碳球修饰后，反应表面积增大，电催化活性增强，反应速率加快，并且Pt/Cs/GC电极的导电性大于Cs/GC电极。

在铁氰化钾溶液中，依次对裸GC电极、Cs/GC电极、Pt/Cs/GC电极进行交流阻抗扫描，结果如图2所示。由图2可知，Cs/GC电极的电阻约为700 Ω，Pt/Cs/GC电极的电阻约为200 Ω，AChE/Pt/Cs/GC电极的电阻约为1 000 Ω。所以Pt/Cs/GC电极的导电性比Cs/GC电极强，灵敏度更高；AChE为非导电物质，可以阻碍电子的转移，所以AChE/Pt/Cs/GC电极的电阻较大，说明酶已被很好地固定在电极上。

2.2不同AchE传感器的电化学行为

图3为不同电极在1.5 mmol/L氯化乙酰胆碱(ATCl)PBS缓冲溶液中的差分脉冲伏安图。由图可知，AChE/GC电极上的峰电流为0.713 6 μA,AChE/Cs/GC电极上的峰电流为1.260 μA，AChE/Pt/Cs/GC电极上的峰电流为1.763 μA。与AChE/GC电极相比，电极经Cs和Pt/Cs修饰后电流值分别增加了76.57%和147.06%。由此可知，用Cs和Pt/Cs修饰的玻碳电极，具有较高的电催化活性以及较好的电极灵敏度，且用Pt/Cs具有更好的效果。

2.3有机磷农药的抑制

2.4抑制时间的选择

在1.5 mmol/L的ATCl溶液中加入2.0×10-6g/L乐果标准液后，每隔2 min用差分脉冲伏安法扫描，作抑制率与时间的折线图。结果显示，随着抑制时间的增加，抑制率增大。16 min后，抑制率趋于平缓。因此，选择乐果对酶的最佳抑制时间为16 min。

2.5标准曲线的绘制

在AChE/Pt/Cs/GC电极上，加入不同浓度的乐果标准溶液，16 min后用差分脉冲伏安法扫描，计算乐果的抑制率，绘制乐果浓度的负对数与抑制率的关系曲线。结果表明，抑制率随其浓度的增加而增加，在1.0×10-9~1.0×10-6g/L浓度范围内，抑制率(A)与乐果浓度(C)的负对数呈良好的线性关系。线性方程为A=-7.100 lgC+89.07，相关系数(r2)为0.996 7。按照抑制率为10%计算，得到检出限为7.3×10-12g/L。

2.6实际样品的检测

表1　样品的平均加标回收率

将AChE/Pt/Cs/GC修饰电极置于含有1.5 mmol/L ATCl的PBS溶液中，用差分脉冲伏安法扫描，记录其峰电流。然后将电极置于含有1.5 mmol/L ATCl的纺织品样品提取液(PBS提取,不含农药)中，加入3种不同浓度的乐果标准品后，进行差分脉冲伏安法扫描，平行测定5次，计算其平均回收率(见表1)。结果显示，样品的回收率为86.2%~101.7%，相对标准偏差(RSD)为1.7%~10.4%，方法的准确度与精密度可以满足实际检测的需求。

3结论

利用新型的纳米材料铂/碳球，构建乙酰胆碱酯酶生物传感器。铂/碳球/乙酰胆碱酯酶修饰电极能够催化底物氯化硫代乙酰胆碱的氧化还原反应。农药乐果对乙酰胆碱酯酶的催化活性能够产生抑制，纳米材料铂/碳球的纳米结构可以辅助固定生物分子，提高检测灵敏度。据此可以实现对纺织品中农药乐果的测定，建立纺织品中农药乐果的筛选方法。与传统的气相色谱-质谱方法相比，该方法可以大大减少有机试剂的消耗，缩短检测时间。

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Acetylcholinesterase Biosensor Based on Pt/Carbon Spheres for the Detection of Dimethoate

WU Li-na*，CAO Xi-zhong,CAI Jian-he

(Jiangsu Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing210001，China)

Abstract：A biosensor for dimethoate was prepared by exploiting their inhibitory effect on the activity of acetylcholinesterase(AChE).Carbon/Pt sphere material with good chemical stability, large surface area and good conductivity was used to modify the electrode.Compared to a bare electrode, the electron transfer resistance of the prepared electrode is lower,and its peak current is increased by 147.06%.This is ascribed to the larger surface of the Carbon/Pt ball material which could improve theadsorption for AChE and enhance its activity.Under the optimal experimental conditions , the concentration of negative logarithm of dimethoate and inhibition ratio showed a good linear relationship from 1.0×10-9g/L to 1.0×10-6g/L.The detection limit was 7.3×10-12g/L(the inhibition rate was 10%).The spiked recoveries for textile samples were in the range of 86.2%-101.7%.The method may provide a new way to fabricate highly sensitive biosensors for the detection of organophophate pesticides in textile.

Key words：Pt/Porous carbon spheres;biosensor;acetylcholinesterase;dimethoate;textile

中图分类号：O657.1；F767.2

文献标识码：A

文章编号：1004-4957(2016)02-0241-04

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.02.018

*通讯作者：吴丽娜，博士，高级工程师，研究方向：纺织品检测、分析化学，Tel：025-52345220，E-mail：12889788@qq.com

基金项目：国家质检公益性行业科研专项(201310059)；国家质检总局基金资助项目(2014IK166)

收稿日期：2015-07-22；修回日期：2015-08-04