加味天雄散对弱精子症患者精子P38MAPK/ERK信号通路的影响*

耿 强，郭 军，王 福，韩 强，高庆和，赵 玉，李 重，余国今，欧阳斌

(1.天津中医药大学第一附属医院男科，天津 300193;2.中国中医科学院西苑医院男科，北京 100091; 3.首都医科大学附属北京中医医院男科，北京 100010)

加味天雄散对弱精子症患者精子P38MAPK/ERK信号通路的影响*

耿 强1，郭 军2，王 福2，韩 强3，高庆和2，赵 玉1，李 重1，余国今2，欧阳斌1

(1.天津中医药大学第一附属医院男科，天津 300193;2.中国中医科学院西苑医院男科，北京 100091; 3.首都医科大学附属北京中医医院男科，北京 100010)

研究加味天雄散对弱精子症患者精液p38MAPK/ERK信号传导通路的影响。方法:临床选取弱精子症患者分为正常组、弱精组、补肾组、健脾组、全方组，分别对补肾、健脾、全方组给予3个月的治疗，治疗后观察3组患者的精液常规指标，并测定5组ERK、P38磷酸化和蛋白表达水平。结果:各组与治疗前比较，A级精子和A+B级精子百分率均上升，差异有统计学意义;与对照组、补肾组、健脾组治疗后比较，全方组A级精子和A+B级精子百分率改善更明显，差异有统计学意义;与正常组比较，弱精组患者精子ERK蛋白表达明显升高，全方组ERK蛋白表达较补肾组降低更为明显;与正常组比较，弱精组患者精子P38表达及PP38明显升高，全方组P38表达及PP38较补肾组降低更为明显。结论:补肾健脾治法可以改善弱精子症患者精子活力，可能与抑制p38MAPK/ERK信号通路有关。

加味天雄散;弱精子症;p38MAPK信号传导通路

随着社会竞争压力的增大和环境污染的日趋严重，男性生殖能力呈下降趋势。世界卫生组织研究发现，大约有15%的婚后夫妇存在不能正常生育的问题［1］，弱精子症已成为影响男性生育能力的最常见原因［2］。近年来国内外基础研究发现，ROS(活性氧)产生过多可能是造成男性不育症的重要病因之一［3］，而ROS是MAPK信号通路强有力的激活剂，在MAPK传导通路的一些组成成分，如细胞外信号调节激酶(ERK)、P38MAPK信号通路和精子活动力密切相关。我们在既往的临床和动物实验研究中发现，补肾健脾类中药能够起到抗氧化损伤、提高精子活力的作用。本研究观察加味天雄散对弱精子症患者精子的P38MAPK/ERK通路表达的影响，现报道如下。

1 临床资料

1.1 病例选择

选取2014年6月至2015年3月就诊于天津中医药大学第一附属医院男科门诊的患者，诊断参照《WHO人类精液及精子－宫颈黏液相互作用实验室检验手册》(第4版)规范，正常禁欲间隔时间内测试2次精液，如果精液量大于3 ml，精子密度超过20×106/ml，A级少于25%或者A+B级少于50%即可诊断为弱精子症(注:精子活动力分级精子运动级别:A级:快速前向运动精子;B级:慢或呆滞的前向运动精子;C级:非向前运动精子;D级:不动精子)。

1.2 纳入标准

符合《人类精液及精子－宫颈黏液相互作用实验室检验手册》(第4版)标准;男性年龄24～45周岁，病程1～4年;近1年内夫妻感情稳定，有正常的性生活。

1.3 排除标准

年龄＜25周岁或＞45周岁;妻子伴发严重的生殖系统疾病;男方伴发性功能障碍，如阳痿、早泄、性欲低下等;男方服用放化疗药物影响生殖能力者;男方合并梗阻性泌尿系统疾病、三度静脉曲张;并发严重的心脑血管病等原发性疾病;严重的精神疾患;不符合纳入标准或病例记录不全等影响疗效者。

1.4 分组

将弱精子症患者分为加味天雄散全方组、补肾组、健脾组、弱精症组4组各30例，并设精液检查正常者30例。弱精症组诊断为弱精症者，无生育要求，并不接受药物干预治疗者，而全方组、补肾组、健脾组3组接受治疗。

1.5 治疗手段

加味天雄散组成:附子(先煎)6 g，丹参10 g，刺五加10 g，肉苁蓉10 g，枸杞子20 g，菟丝子15 g，黄芪10 g，白术15 g，制首乌15 g，桂枝10 g，茯苓15 g，龙骨10 g(先煎);补肾组组成:附子6 g(先煎)，丹参10 g，刺五加10 g，肉苁蓉10 g，枸杞子20 g，菟丝子15 g，制首乌15 g，桂枝10 g，龙骨10 g(先煎);健脾组组成:附子6 g(先煎)，丹参10 g，刺五加10g，黄芪10 g，白术15 g，桂枝10 g，茯苓15 g，龙骨10 g(先煎)。

1.6 疗程及服药方法

中药饮片采用代煎，由天津中医药大学第一附属医院制剂室提供，每剂中药一次性煎至300 ml，分成2袋小包装，每袋各150 ml，每天2次饭后口服，每次150 ml，加味天雄散全方组、补肾组、健脾组进行治疗，3个月为1个疗程，共治疗1个疗程。

1.7 检测指标

1.7.1 精液常规分析 患者在检验前禁欲2～7 d，化验前注意休息，避免刺激食物，在天津中医药大学第一附属医院男科取精室完成取精后立即送实验室恒温箱。精液分析采用北京中科恒业科技有限公司生产的精液分析仪进行分析，由专业实验人员完成。

1.7.2 P38MAPK和ERK蛋白表达、磷酸化水平变化 ①蛋白提取:将－196℃液氮中保存的精子取出，迅速置于37℃水浴锅内解冻，4℃预冷的PBS(0.1 mol/L pH7.4)洗涤3～4次，转移到玻璃研磨器中，向研磨器中加入细胞裂解液，冰浴研磨裂解10 min，移入准备好的1.5 ml离心管中超速离心4℃、12000 r/min，时间为15 min。将离心后的上清液转移到另一洁净的1.5 mlEp管中，测定上清液总蛋白浓度后调整蛋白浓度，将上述上清液与计算后所需要的loading buffer混合，水浴锅煮沸10 min。②Western印迹检测:一抗ERK、PERK、P38、PP38抗体购自abcam公司，二抗均购自北京百奥思科生物医学科技有限公司。操作方法:首先制备 SDSPAGE凝胶，然后10%SDS-PAGE电泳，电泳结束后转膜到硝酸纤维素膜，一抗过夜后用辣根过氧化物酶标记的二抗对待测蛋白进行孵育、检测。

将上述膜室温封闭2 h，PBST液漂洗3次，每次 10 min，分别加入 ERK、P38MAPK、PERK、PP38MAPK抗体(1∶800)4℃孵育过夜。次日以PBST漂洗3次，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶1000)二抗孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10 min，ECL化学发光法显影。洗去硝酸纤维素膜上结合的一抗、二抗，室温下以封闭液继续封闭2 h。内参选用 β-actin抗体(1∶1000)作为一抗，重复Western blot实验，实验结束后用Quantity One软件扫描条带灰度值。各组中ERK、PERK、P38MAPK、PP38MAPK的表达水平分别用目的蛋白条带与内参蛋白条带灰度值比较，ERK、P38MAPK活性分别采用PERK与ERK、PP38MAPK与P38MAPK条带灰度值之比表示，并使用内参蛋白进行校正。

2 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计分析，一般计量资料采用方差分析，计数资料采用卡方检验，等级资料采用秩和检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

3 结果

本次研究中对照组3例、补肾组2例患者失访，健脾组2例、全方组1例患者因工作调动主动退出本研究，其余患者完成本次研究。其中全方组患者年龄(28.8±3.8)岁，病程(2.9±2.3)年;补肾组患者年龄(28.1±3.9)岁，病程(2.8±2.9)年;健脾组患者年龄(29.1±3.8)岁，病程(3.1±2.3)年;弱精症组患者年龄(28.2±4.1)岁，病程(2.9±2.2)年;正常组年龄(28.9±3.4)岁，5组研究病例年龄、病程比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

3.1 治疗后加味天雄散及其拆方对弱精子症患者精子活力的变化

表1可见，补肾组、健脾组、全方组与治疗前比较，精子活力百分率均上升，差异有统计学意义(P＜0.01);与对照组补肾组、健脾组治疗后比较，全方组A级精子和A+B级精子百分率改善更明显(P＜0.01)，差异有统计学意义。

表1 各组治疗前后精子活力比较(±s)

表1 各组治疗前后精子活力比较(±s)

注:与同一组治疗前比较:*P ＜0.01;与对照组治疗后比较:#P＜0.01;与健脾组治疗后比较:△P＜0.01;与补肾组治疗后比较:$P＜0.05

组 别 例数 时 间 A级精子(%) A+B级精子(%)补肾组 28 治疗前13.24±4.98 28.10± 8.45治疗后 20.35±7.43* 47.72±12.64*健脾组 28 治疗前 14.12±5.215 28.31± 8.14治疗后 19.96±8.67* 46.67±12.19*全方组 29 治疗前 14.78±4.13 27.31± 8.34治疗后 27.26±8.91*#△$ 58.44±13.12*#△$

3.2 加味天雄散治疗后患者精子ERK和P38磷酸化和蛋白表达水平的变化

图1 加味天雄散对弱精子症患者MAPK信号通路p38的影响

表2图1、2可见，与正常组比较，弱精组患者精子ERK蛋白表达明显升高;与弱精组比较，药物干预组中，补肾组和全方组精子ERK蛋白显著降低，健脾组无明显改变，全方组ERK蛋白表达较补肾组降低更为明显;与正常组比较，弱精组患者精子P38表达及PP38明显升高;与弱精组比较，药物干预组中，补肾组和全方组精子ERK蛋白显著降低，健脾组无明显改变，全方组P38表达及PP38较补肾组降低更为明显。

4 讨论

随着环境污染的日益加重和生活压力的增大，男性不育症已成为困扰患者和医生的重要问题，引起人们的广泛关注，男性不育的发生与精子活动力低下有着直接的关系［4］。引起精子活力低下的病因较多，如生殖道炎症、精液不液化、精索静脉曲张、内分泌饮食、药物性饮食等，还有约20% ～40%的患者尚未发现明确的病因，称之为特发性，现代医学并未确切的药物进行治疗［5］。随着基础研究的不断深入，ROS对男性生殖能力的影响目前已被广为关注，精液中的超氧化物歧化酶可以清除过多的活性氧，否则精子活力会受到影响［6］。活性氧可作为诱发剂，引起细胞信号的传导，对于线粒体的能量代谢有着重要的作用［7］。氧自由基是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路强有力的激活剂。目前MAPK信号通路对成熟精子调控的报道越来越多，MAPK属于丝/苏氨酸蛋白激酶系列，负责调节细胞的生长、分化及对环境的应激适应等多种重要的细胞生理病理过程。有报道，其家族成员细胞外信号调节激酶(ERK1/2)和P38MAPK参与精子活动力的调节，P38MAPK存在于精子尾部中上段［8］。近年来国内学者也研究发现，ERK和P38MAPK在正常精子和弱精子症患者精子中均有表达，ERK、P38MAPK蛋白表达水平和P38MAPK磷酸化水平在弱精子症患者组显著升高，可见P38MAPK/ERK信号通路与精力活力有着密切关系［9］，可能是引起精子活力低下的原因。

表2 治疗后各组精子ERK及P38MAPK灰度值的比较(±s)

表2 治疗后各组精子ERK及P38MAPK灰度值的比较(±s)

注:与正常组比较:*P＜0.05;与弱精组比较:#P＜0.05;与健脾组比较:△P＜0.05;与补肾组比较:$P＜0.05

组 别 ERK/β-actin PERK/β-actin P38/β-actin PP38/β-actin正常组0.44±0.12 0.31±0.12 0.59±0.20 0.32±0.09弱精组 0.77±0.22* 0.30±0.13 0.98±0.22* 0.71±0.13*补肾组 0.58±0.18# 0.29±0.11 0.79±0.19*# 0.58±0.12*#健脾组 0.69±0.21* 0.31±0.09 0.89±0.23* 0.64±0.11*全方组 0.47±0.15#△ 0.32±0.08 0.63±0.21*#△ 0.36±0.08*#△$

图2 加味天雄散对弱精子症患者P-ERK通路的影响

图3 加味天雄散对弱精子症患者P-P38通路的影响

中医学在经典著作《黄帝内经》里提出肾主生殖的学说，提出“丈夫二八肾气盛，天癸至，精气溢泻，阴阳和，故能有子”，男性不育症的治疗以补肾为主，我国学者也进行了相关的流行病学研究。大量的病例研究发现，男性不育症肾虚患者占总病例的61.4%，可见肾虚为男性不育症发病的主要病机［11］。除肾虚之外，男性不育的发生也与脾相关，因为脾为后天之本，气血生化之源［12］。我们课题组近年来研究发现，采用脾肾同治能有效提高男性不育症的临床疗效，证实补肾健脾法疗效优于单一补肾法［13］。前期的实验研究也发现，基于补肾健脾治法的加味天雄散能够提高少弱精子症模型大鼠精浆SOD活力，降低精浆MDA水平，提高精浆组织中的抗氧化水平，提高精子的活力［14］。

天雄散出自古籍《金匮要略》，首次在虚劳病中提出脾肾同治，提出对复杂病证治疗的重点是补脾胃、建中气，以达治疗疾病的目的。健脾补肾法在加味天雄散组方配伍中有良好的体现，白术、茯苓益气健脾，肉苁蓉补肾填精，制首乌补肝肾，菟丝子补肾益精、养肝明目，从而达到脾肾同治的效果。为此我们在本次研究中也进行了拆方研究，分为健脾、补肾、全方组，分别比较3种中医治法治疗弱精子的临床疗效以及对MAKP信号通路的影响。研究发现，与补肾组、健脾组治疗后比较，补肾健脾法组A级精子和A+B级精子百分率改善更明显;与正常组比较，弱精组患者精子ERK蛋白表达明显升高;与弱精组比较，全方组ERK蛋白表达较补肾组降低更为明显;与正常组比较，弱精组患者精子P38表达及PP38明显升高;与弱精组比较，全方组P38表达及PP38较补肾组降低更为明显。

本研究以不育中最常见的弱精子症为载体，进行3种中医治法的比较，发现基于补肾健脾法的加味天雄散可以改善弱精子症患者精子活力，可能与抑制p38MAPK信号通路有关。从信号传导通路方向研究探讨补肾健脾法治疗弱精子症的作用机制，对于探索研究脾肾同治法的作用机制具有重要意义，对于完善脾肾相关论、促进其理论物质基础研究、提供相关的实验依据有着重要的意义。

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R698+.2

B

1006-3250(2016)06-0788-04

2015-10-25

国家自然科学基金青年基金项目(81202695);中国中医科学院优势病种资助项目(CACMS08Y0025)

耿 强，河北承德人，主治医师，医学硕士，从事中西医结合男科的临床与研究。

△通讯作者:郭 军，主任医师，博士研究生导师，Tel:010-62835134，E-mail:guojun1126@126.com。